العمل مع الخلايا السمعية مؤسسات التعليم العالي-OC1

الهدف العام من هذا البروتوكول هو وصف الإجراءات الأساسية للعمل مع خلايا HEI-OC1 ، والتي يمكن استخدامها لدراسة تأثيرات الأدوية الدوائية على الخلايا السمعية ، والمساعدة في التوصيف الوظيفي للبروتين الحركي بريستين. يستخدم العديد من الباحثين خلايا HEI-OC1 في تجارب مختلفة بأهداف مختلفة وباستخدام تقنيات مختلفة. نأمل أن توفر الإجراءات الموصوفة هنا قاعدة مشتركة لجعل هذه الدراسات قابلة للمقارنة.

بالطبع ، يمكن تحسين هذه الإجراءات التجريبية بشكل أكبر. لكن الاختلافات مع تلك الموصوفة هنا يمكن أن تكون مفتاحا لفهم وشرح النتائج المتناقضة المحتملة. في هذا العرض التوضيحي ، سنصف كيفية العمل مع خلايا HEI-OC1 بدءا من حصة مجمدة إلى الحصول على عينات جاهزة لإجراء دراسات مختلفة بتقنيات متاحة على نطاق واسع.

لبدء هذا الإجراء ، قم بإزالة قارورة من خلايا HEI-OC1 المحفوظة بالتبريد من النيتروجين السائل وضعها في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. اغمر النصف السفلي فقط من القارورة واتركها تذوب حتى تبقى كمية صغيرة فقط من الجليد في القارورة. في خزانة السلامة البيولوجية ، امسح الجزء الخارجي من القارورة بنسبة 70٪ كحول.

بعد ذلك ، قم بتوصيل الخلايا من القارورة وتوصيل الحجم بالكامل قطرة قطرة ، ببطء ، في أنبوب مخروطي 15 مليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من وسط النمو الدافئ مسبقا مثل DMEM المكمل بنسبة 10٪ FBS. بعد ذلك ، قم بإزالة DMSO عن طريق الطرد المركزي للأنبوب لمدة خمس دقائق. بعد خمس دقائق ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في تسعة ملليلتر من وسط النمو الجديد.

بفصل الكتل أو صفائح الخلايا عن طريق تدفق الخلايا العالقة وإعادة ارتجاعها بين الماصة والوسط ثلاث إلى أربع مرات مع لمس طرف الماصة قاع الأنبوب. بعد ذلك ، ضع الحجم الكلي للخلايا المعلقة في وسط النمو في طبق زراعة الخلايا البلاستيكية غير المعالج بقطر 100 ملم. احتضان الخلايا عند 33 درجة مئوية مع 10٪ ثاني أكسيد الكربون.

في هذه الخطوة ، قم بإزالة الوسط القديم وغسل الخلايا بملليلترين من PBS. ثم قم بتغطية طبقة الخلية أحادية الطبقة بنسبة 0.25٪ تريبسين. افحص الخلايا باستخدام مجهر مقلوب عند فصل 40٪ منها.

إذا لزم الأمر ، قم بهز طبق المزرعة برفق لتحرير أي خلايا متبقية متبقية أعد تعليق الخلايا وإزالة التربسين عن طريق الطرد المركزي للأنبوب لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في تسعة ملليلتر من وسط النمو الطازج. بعد ذلك، قم بتقسيم كتل أو صفائح الخلايا عن طريق تدفق الخلايا العالقة وإعادة ارتجاعها بين الماصة والوسط، ثلاث إلى أربع مرات مع ملامسة طرف الماصة لقاع الأنبوب.

استمر في زرع الخلايا في أطباق زراعة الخلايا بقطر 100 ملم. احتضنها عند 33 درجة مئوية مع 10٪ CO2 وقسمها عدة مرات حسب الضرورة للتجارب المخطط لها ، أو لتوليد مخزون جديد. للتمايز ، احتضان خلايا HEI-OC1 في الظروف المتساهلة حتى تصل إلى حوالي 80٪ من التقاء.

بعد ذلك ، احتضان الخلايا عند 39 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع وقم بتغيير الوسط كل يومين لإزالة الخلايا الميتة. ابدأ هذا الإجراء عن طريق عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الأوتوماتيكي أو مقياس كثافة الدم واضبط تركيز الخلية على القيمة المطلوبة. بعد ذلك ، قم بزرع الخلايا في صفيحة مسطحة ذات 96 صفيحة قاع شفافة ، أو صفيحة بيضاء الجدران 96 ، أو صفيحة بستة آبار.

إذا لزم الأمر من قبل الفحص المعين ، فقم باحتضان الخلايا طوال الليل لربط الركيزة قبل معالجتها بالأدوية ذات الأهمية. بعد ذلك ، قم بقياس نتيجة العلاج عن طريق قياس التدفق الخلوي أو أي تقنية مناسبة أخرى. لحصاد الخلايا ، اغسلها مرتين ب 10 مل من PBS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم.

أضف ملليلترين من محلول الفصل الخالي من الإنزيم واحتضان الخلايا لمدة ثلاث دقائق عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. استخدم مجهرا مقلوبا للتحقق من انفصال الخلايا. إذا لزم الأمر ، حرك طبق زراعة الخلايا برفق لفصل المزيد من الخلايا ، واحرص على عدم هزه.

بعد ذلك ، أضف 10 ملليلتر من DMEM بالإضافة إلى 10٪ FBS وقم بسحب الخلايا لأعلى ولأسفل ، برفق ، خمس مرات. بعد ذلك ، انظر إلى الخلايا تحت المجهر. إذا تم فصل أكثر من 80٪ من الخلايا بالفعل ، فلا داعي لمزيد من سحب العينات.

إذا كانت الخلايا لا تزال في مجموعات، فاستمر في سحب العينة برفق حتى تختفي أكثر من 80٪ من الخلايا في مجموعات. يجب أن يظهر التحكم البصري في الخلايا العديد من الخلايا المستديرة المفردة ذات حواف الغشاء الملساء. بعد ذلك ، تابع قياسات مشبك التصحيح و NLC ، كما هو موضح في بروتوكول النص.

أظهرت خلايا HEI-OC1 المزروعة في ظروف غير متساهلة انخفاضا كبيرا للغاية في بقاء الخلايا ، وزيادة كبيرة بنفس القدر في موت الخلايا فيما يتعلق بمزارع الخلايا في ظروف متساهلة. نظرا لأن تأثيرات الدواء على الخلايا التي تحتضر بالفعل أو ذات قابلية منخفضة للبقاء يمكن أن تكون مختلفة عن تأثيرات نفس الدواء على الخلايا السليمة ، يجب تكريس جهود كبيرة للتمييز بين تأثيرات الدواء وتأثيرات ظروف الثقافة في أي دراسة سمية خلوية يتم إجراؤها على خلايا NP-HEI-OC1. لذلك ، نوصي باستخدام خلايا HEI-OC1 المزروعة في ظروف متساهلة للتجارب التي لا تتطلب على وجه التحديد خلايا متمايزة.

تؤكد الصور متحد البؤر الموضحة هنا التعبير عن البروتين الحركي السمعي بريستين في خلايا HEI-OC1 المزروعة عند 33 درجة مئوية و 39 درجة مئوية. لاحظ أن البريستين يتحول في الغالب إلى السيتوبلازم لخلايا HEI-OC1 التي تنمو في الظروف المتساهلة ، وهو أكثر تركيزا في غشاء البلازما في الخلايا الأكثر تمايزا. أظهرت دراسات قياس التدفق الخلوي زيادة واضحة في تعبير البريستين في كلتا الحالتين ، مما يشير إلى أن الإزاحة كانت مصحوبة بتخليق المزيد من جزيئات البريستين.

من ناحية أخرى ، أظهرت دراسات الفيزيولوجيا الكهربية وجود NLC قوي في خلايا HEI-OC1 تنمو عند 33 درجة مئوية ، مع انخفاض قيمة الذروة والجهد عند ذروة السعة التي تحولت إلى القيم الأكثر استقطابا حيث تم نقل الخلايا إلى الظروف غير المسموح بها لمدة أسبوع وأسبوعين. ومن المثير للاهتمام أن هذه النتائج تشير إلى أن الوظيفة الحركية يمكن أن تتعرض للخطر إذا كانت كثافة جزيئات البريستين في غشاء البلازما عالية جدا. من المهم أن تتذكر أن البروتوكولات الموضحة هنا تتطلب الاستخدام الصحيح لتقنيات زراعة الخلايا الراسخة.

أيضا تجنب استخدام المضادات الحيوية. بالإضافة إلى ذلك ، تذكر أن النمط الظاهري واستجابة خلايا HEI-OC1 سيعتمدان بشدة على معلمات الثقافة.