تصميم واستخدام ومنخفضة التكلفة، الآلي Morbidostat عن التكيف تطور البكتيريا تحت المضادات الحيوية اختيار الدواء

الهدف العام من هذه التجربة هو توصيف المسار التطوري للمقاومة الحيوية باستخدام جهاز "موربيدوستات" (Morbidostat) الذي يراقب النمو البكتيري باستمرار ويضبط تركيز المضاد الحيوي ديناميكيًا مع اكتساب البكتيريا لمقاومة الدواء. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أن الجهاز يتكون من مكونات إلكترونية منخفضة التكلفة ومتوفرة بسهولة، ويمكن إعادة تكوينه بسهولة لأغراض محددة. سيقوم بشرح الإجراءات كل من Po Cheng Liu و Yi Tai Lee، وهما طالبان في مرحلة الدراسات العليا في مختبري.

لتجميع جهاز الموربيدوستات (Morbidostat)، ابدأ باستخدام إبرة قياس 18 gauge لثقب ثلاثة ثقوب في غطاء قارورة المزرعة. قص ثلاث قطع من أنابيب البولي إيثيلين بطول سبعة سنتيمترات تقريباً وأدخلها في الثقوب الموجودة في الغطاء. استخدم شريطاً لاصقاً للف حافة الغطاء ليكون بمثابة قالب لخليط البولي ثنائي ميثيل سيلوكسان، أو PDMS.

ثم أضف خمسة جرامات من المكون A و 0.5 جرام من المكون B من الـ PDMS في حاوية بلاستيكية سعة 150 ملليلتر واستخدم عود أسنان لتقليبه يدويًا. قم بتعبئة الخليط في سرنجة سعة 10 ملليلتر. بعد ذلك، وباستخدام السرنجة، احقن خليط الـ PDMS على الغطاء.

يُخبز الغطاء بالكامل عند درجة حرارة 70 °C لمدة ثماني ساعات لمعالجة الـ PDMS. بعد ذلك، وباستخدام مكواة لحام، يتم لحام مصعد الـ LED بسلك قياس 24 gauge ومهبط الـ LED بمقاومة كربونية. ثم يتم لحام مقاومة كربونية بقيمة 680 Ohm بسلك قياس 24 gauge.

استخدم شريطاً لاصقاً عازلاً لعزل توصيلات الأسلاك. قم بلحام جامع (collector) الكاشف الضوئي بسلك قياس 24 gauge، ولحام باعث (emitter) الكاشف الضوئي بمقاومة كربونية قدرها 100 Ohm. ثم استخدم شريطاً لاصقاً عازلاً لعزل توصيلات الأسلاك.

ضع الثنائي الباعث للضوء في حامل وعاء المزرعة. قم بتوصيل الثنائي الباعث للضوء باتباع المخطط الدائري الموضح هنا، واستخدم مصدر طاقة بجهد 5 volt لتشغيله. تأكد من عمل الـ LED باستخدام كاميرا رقمية يمكنها اكتشاف الأشعة تحت الحمراء (IR). الآن، ضع الكاشف الضوئي في حامل وعاء المزرعة.

بعد ذلك، وباتباع المخطط، قم بتوصيل الكاشف الضوئي واستخدم مزود طاقة بجهد 5 volt لتشغيله. قم بتوصيل السلك بكلا جانبي مقاومات الكاشف الضوئي لقياس الجهد عبر لوحة التحكم الإلكترونية. قم بلصق مغناطيس على محور مروحة التبريد التي تعمل كوحدة تقليب مغناطيسي.

بما أن وحدة التقليب المغناطيسي تتكون من المغناطيس ومروحة التبريد، فمن الضروري محاذاة رف المروحة مع وعاء المزرعة. كما أن المسافة بين وعاء المزرعة والمغناطيس بالغة الأهمية لضمان التشغيل المستقر. قم بتوصيل كل قطعة من أنابيب البولي إيثيلين الخاصة بوعاء المزرعة بقطعة أنابيب السيليكون المقابلة لها والمخصصة للمضخات الدقيقة، وزجاجات الوسط، وزجاجة النفايات.

قم بتشغيل المضخة لمدة ساعة واحدة وقياس الحجم الإجمالي الذي يتم ضخه من زجاجة الوسط إلى قارورة المزرعة لتحديد معدل الضخ. يجب أن يكون معدل الضخ النموذجي حوالي 4 mL في الساعة، وهو ما يتوافق مع معدل التخفيف D = 0.33 في الساعة لحجم عمل قدره 12 mL لقارورة المزرعة. عند اكتمال الإعداد، ضع المجموعة بأكملها في حاضنة هزازة متوسطة الحجم.

لاختبار جهاز الموربيدوستات (Morbidostat) مسبقاً، اضبط جهد مصدر الطاقة لمروحة التبريد على 5 volts لتشغيل محركها واختبار قضيب التقليب المغناطيسي. بعد تحضير سلسلة من عينات E-coli ورسم منحنى معايرة وفقاً لبروتوكول النص، جهز قارورة المزرعة باستخدام ثلاثة أنابيب Tygon مقاومة للمواد الكيميائية فائقة الجودة بطول 7 cm، وبقطر داخلي يبلغ 1/32 inch وقطر خارجي يبلغ 3/32 inch لتكون مداخل لتشكيل الجهاز. قم بتحضير وسط M9 الأدنى مع 0.2% glucose ووسط M9 يحتوي على عقار Trimethoprim أو TMP.

بعد ذلك، قم بتعقيم الوسط، وزجاجة الوسط، وزجاجة وسط الدواء، وزجاجة النفايات، وقارورة المزرعة في جهاز التعقيم (autoclave) عند 121 درجة Celsius. في اليوم الأول من التجربة، قم بإذابة 1 mL من خلايا E-coli MG1655 من النوع البري المجمدة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق، وانقل 120 µL من الخلايا إلى قارورة مزرعة تحتوي على 12 mL تقريبًا من وسط النمو M9. قم بتشغيل الحاضنة الهزازة واضبط درجة الحرارة على 30 درجة Celsius بدون هز.

ابدأ تشغيل جهاز الموربيدوستات (Morbidostat) عن طريق تشغيل المضخة الدقيقة، ووحدة التقليب المغناطيسي، وقياس الكثافة الضوئية. بعد مرور 23 ساعة تقريباً، أوقف المضخة الدقيقة عن طريق قطع جهد التغذية الكهربائية عنها وأخرج قارورة المزرعة. أضف 15% glycerol إلى قارورة المزرعة وجمد العينات عند درجة حرارة 80- درجة مئوية للتخزين.

يعد الانتقال إلى قارورة مستنبت جديدة في بداية كل تجربة من هذه التجارب أمراً هاماً أيضاً لتجنب تكوّنات البيوتين. وإلا فقد يحدث تكوّن البيوتين في غضون يومين أو ثلاثة أيام. بعد إذابة العينة المجمدة يومياً في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق، قم بتلقيح أنبوبة اختبار جديدة بوسط M9 طازج.

ضع العينة في حاضنة هزازة عند 37 درجة مئوية طوال الليل. وفي اليوم التالي، استخدم وسط M9 لتخفيف العينة الميكروبية بمقدار عشرة أضعاف، ثم قم بتحميلها في الجهاز الموائع الدقيقة عن طريق تسليط ضغط قدره 5 PSI على حاوية العينة الميكروبية. بعد ذلك، قم بتحميل الوسط المحتوي على TMP في الشريحة عن طريق تسليط ضغط قدره 5 PSI على حاوية وسط M9 مع TMP.

قم بإجراء عملية الخلط بين الميكروب والعقار عن طريق تفعيل الصمام الميكانيكي الدقيق الموجود بين الغرفتين في شريحة الموائع الدقيقة لمدة 15 دقيقة. أخيراً، ضع شريحة الموائع الدقيقة في حاضنة المجهر المثبتة على المجهر المقلوب. وباستخدام كاميرا CCD، التقط صوراً للخلايا في غرفة النمو كل ساعة لمدة ثماني ساعات.

احسب بيانات عدد الخلايا وفقاً للبروتوكول النصي. تم التحقق من عمليات Morbidostat الشائعة، بما في ذلك التطور التجريبي، واختبار الحساسية للمضادات الحيوية، وفحص مورفولوجيا الخلايا، باستخدام مزرعة E-coli MG1655 معرضة للمضاد الحيوي TMP، والذي يحفز زيادة تدريجية مميزة في مقاومة الدواء مع تركز الطفرات حول جين dihydrofolate reductase، أو DHFR. ومن المتوقع أن ينمو الميكروب يومياً فوق عتبة الكثافة الضوئية المحددة مسبقاً، مما يؤدي إلى تحفيز حقن الدواء كما هو موضح هنا.

من المتوقع أن يؤدي حقن الدواء إلى تثبيط النمو، وبالتالي خفض الكثافة الضوئية. يوضح هذا المخطط الزيادة الزمنية في مقاومة الدواء المضاد للميكروبات في تجربة لتحديد IC50. وقد زادت مقاومة الدواء بنحو 1500 ضعف لتصل إلى 1,000 micrograms per milliliter على مدار 12 يوماً تقريباً.

تتسق هذه النتائج مع الاكتشافات السابقة. وقد تم قياس طفرات DHFR النقطية في الطافر من اليوم الأخير بواسطة تسلسل سانجر، وهي مدرجة في هذا الجدول. ويثبت اكتساب المقاومة الدوائية من خلال طفرات متعددة مدى فائدة جهاز Morbidostat.

بما أن الاختيار على أطباق الآجار التي تحتوي على العقاقير يميل إلى منح طفرة واحدة فقط، يوضح هذا الشكل منحنيات النمو على الشريحة عند تركيزات مختلفة من TMP. وتظهر العينات الطافرة زيادة ملحوظة في مقاومة العقاقير المضادات الحيوية.

بعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لدراسة موضع مقاومة الأدوية المضادة للمضادات الحيوية في بيئة مختبرية رقابية حقيقية. وعقب هذا الإجراء، يمكن إجراء قياسات أخرى مثل قياس الخلية الواحدة بالسوائل الدقيقة للإجابة على أسئلة إضافية، مثل ما إذا كانت المورفولوجيا لا تزال تتغير نتيجة التعرض للأدوية المضادة للمضادات الحيوية. وبمجرد إتقان استخدامه، يمكن إعادة تكوين هذا الجهاز بسهولة لجميع تجارب المزارع البكتيرية، مثل زراعة سلالة من البكتيريا أو زيادة مستوى تحمل التكلفة لسلالة بكتيرية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يتكون لديك فهم جيد لكيفية دراسة اكتساب مقاومة الأدوية المضادة للمضادات الحيوية في تجربة تطورية مخبرية تكيفية مضبوطة وواقعية. لا تنسَ التعامل مع البكتيريا المقاومة للأدوية وفقاً لقواعد السلامة البيولوجية للممارسة الميكروبيولوجية. قد يتطلب الأمر تصريحاً خاصاً لإجراء تجربة تتضمن تدريباً أساسياً للبكتيريا.