وتوليف الهلاميات المائية functionalized RGD-كأداة للتطبيقات العلاجية

الهدف العام من هذه المنهجية هو تخليق الهيدروجيلات لتطبيقات هندسة الأنسجة بكل سهولة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال هندسة الأنسجة، مثل إمكانية الحفاظ على حيوية خلوية عالية في أنظمة زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنه باستخدام تفاعل سريع، يمكننا تعديل أنظمة الهيدروجيل بسهولة لتحسين قدرتها على الحفاظ على حيوية الخلايا.

تمتد آثار هذه التقنية لتشمل علاج إصابات الحبل الشوكي، وذلك لأن الخلايا المحملة داخل السقالة يمكنها إعادة بناء الأنسجة التالفة. إذ يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤى قيمة حول العلاجات الخلوية في مجال الطب التجديدي وتطبيقاتها في العديد من المنهجيات. كما يمكن تطبيقها في عدة أنظمة أخرى مثل العظام والقلب والغضاريف.

لتخليق مشتق RGD-azide، أذب 50 milligrams من RGD في one milliliter من sodium hydroxide بتركيز one molar. ثم أذب 24 milligrams من 4-azidobutanoyl chloride في two milliliters من tetrahydrofuran. أضف كامل محلول RGD إلى محلول 4-azidobutanoyl chloride عند درجة حرارة zero degrees Celsius بالتنقيط.

يُترك المزيج ليعود إلى درجة حرارة الغرفة ويُقلب طوال الليل. يُضاف 1 mL من HCL بتركيز 1 M. يُزال المذيب تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار.

قم بتوصيف المنتج الذي تم الحصول عليه باستخدام مطيافية الرنين المغناطيسي النووي للبروتون، مع إذابة العينة في أكسيد الديو تيريوم أو D2O. لإجراء تعديل الألكين لـ PAA، قم بإذابة 200 مليغرام من محلول PAA بتركيز 35% بالوزن في 15 ملي لتر من الماء المقطر. أضف 15.4 مليغرام من هيدروكلوريد البروبارجيل أمين.

ثم قم بإذابة 42.8 milligrams من HOBt في 14 milliliters من محلول أسيتونتريل وماء مقطر بنسبة واحد إلى واحد عن طريق التسخين إلى 50 degrees Celsius. أضف كل محلول HOBt إلى محلول PAA في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أضف 53.6 milligrams من EDC إلى خليط التفاعل.

استخدم حمض الهيدروكلوريك (HCL) بتركيز مولار واحد لضبط الـ pH عند 5.5، ثم قم بتقليب نظام التفاعل طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، أذب 11.2 grams من كلوريد الصوديوم في لترين من الماء المقطر. ثم أضف 200 µL من حمض الهيدروكلوريك (HCL) بتركيز 37% وزن/وزن.

قم بإجراء الديلزة للمحلول باستخدام غشاء بحد قطع للوزن الجزيئي يبلغ 3.5 kilodaltons. استمر في عملية الديلزة لمدة ثلاثة أيام. قم بتغيير محلول الديلزة يومياً باستخدام لترين من الماء المقطر المُحضّر حديثاً والذي يحتوي على 200 µL من HCL بتركيز 37% weight by weight.

يُخزن المحلول النهائي عند درجة حرارة 80- درجة مئوية. يتم توصيف البوليمر الوظيفي باستخدام مطيافية الرنين المغناطيسي النووي للبروتون، وذلك بإذابة العينة في D2O. ولتخليق بوليمر PAA-RGD، تُذاب 78 مليجرام من PAA المعدل بالألكين في 10 مليليتر من الماء المقطر.

ثم قم بإذابة 25 milligrams من مشتق RGD-azide في خمسة milliliters من tetrahydrafuran. أضف كامل محلول RGD إلى المحلول البوليمري. بعد ذلك، أضف 2.2 milligrams من يوديد النحاس.

و 2.2 mg من أسكوربات الصوديوم. يتم تكثيف الخليط الناتج (Reflux) طوال الليل عند 60 °C مع التقليب. ثم يُبرد الخليط حتى 25 °C.

لغسيل المحلول بالديلزة، أذب 11.2 grams من كلوريد الصوديوم في لترين من الماء المقطر وأضف 200 µL من HCL بتركيز 37% وزن/وزن. قم بإجراء عملية الديلزة لمدة ثلاثة أيام، مع تغيير محلول الديلزة يومياً بلترين من الماء المقطر المُحضّر حديثاً والمحتوي على 200 µL من HCL بتركيز 37% وزن/وزن.

ثم ضع المحلول النهائي في درجة حرارة 80- °C. قم بتوصيف وتخزين بوليمر PAA-RGD الناتج كما يتم فعل ذلك مع مكوناته. اخلط 40 mg من الكاربويمر و 10 mg من PAA الوظيفي في 9 mL من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات في درجة حرارة الغرفة حتى الذوبان الكامل.

أضف 400 milligrams من PEG إلى المحلول واستمر في التقليب لمدة 45 minutes. أوقف التقليب واترك النظام ليستقر لمدة 30 minutes. بعد ذلك، استخدم هيدروكسيد الصوديوم بتركيز one molar لضبط الـ PH عند 7.4.

أضف 25 مليجرام من مسحوق الأجاروز إلى خمسة مليلترات من الخليط الذي تم الحصول عليه. قم بتعريض النظام لإشعاع الميكروويف بقدرة 500 وات لمدة تتراوح من 30 ثانية إلى دقيقة واحدة حتى يصل إلى درجة الغليان. ثم قم بتسخين المحلول كهرومغناطيسياً حتى 80 درجة مئوية.

اترك الخليط معرضاً لدرجة حرارة الغرفة حتى تنخفض درجة حرارته إلى 50 °C. بعد ذلك، أضف 5 mL من PBS للحصول على محلول بنسبة حجمية 1:1. جهز طبقاً بـ 12 بئراً يحتوي على أسطوانات فولاذية بقطر 1.1 cm.

خذ أجزاء بمقدار 500 µL من المحلول وضعها في كل أسطوانة فولاذية. اترك اللوحة دون تحريك لمدة 45 دقيقة حتى يكتمل تـجيل النظام. قم بإزالة الأسطوانات باستخدام ملاقط من الفولاذ المقاوم للصدأ للحصول على الهيدروجيل.

راجع البروتوكول المكتوب لتوصيف الخصائص الفيزيائية والكيميائية للهيدروجيلات الوظيفية RGD. يشارك كل من Carbomer 974P وPAA-RGD وPEG، جنباً إلى جنب مع agarose، في عملية تكثيف متعدد إحصائي عشوائي بعد التعرض للإشعاع بالميكروويف. وتتفاعل مجموعات الهيدروكسيل الموجودة في PEG وagarose مع مجموعات الكربوكسيل الموجودة في Carbomer 947P وPAA-RGD لتكوين هيدروجيلات ACPEG-RGD.

وبالنظر إلى الخصائص الريولوجية، وُجد أن معامل التخزين أعلى بنحو ترتيب مقدار واحد من معامل الفقد، مما يشير إلى أن المادة مرنة وليست لزوجية. علاوة على ذلك، يظهر بوضوح أن سلوك الهيدروجيل تهيمن عليه المرونة عند قيم الانفعال المنخفضة. ويُظهر المجهر الإلكتروني الماسح مورفولوجيا عينة من الهيدروجيل الوظيفي RGD وعينة من الهيدروجيل غير الوظيفي.

أظهر كلا الهيدروجيلين أنهما يمتلكان بنية شديدة التشابك من المسام المترابطة، حيث تحتوي بعض المسام الكبيرة على مسام صغيرة وشبكات ليفية على جدران المسام. وتشير هذه الخصائص المتشابهة إلى أن وجود RGD لا يغير من الشبكة البوليمرية. وبعد هذا التطوير، مهدت هذه التقنية الطريق للأبحاث في مجال هندسة الأنسجة لاستكشاف استقرار أنظمة زراعة الخلايا هذه في العديد من الأمراض الأخرى.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية وظيفية الهيدروجيلات، وذلك لتحسين قدرتها على الحفاظ على حيوية الخلايا الجذعية.