وتوليف الهلاميات المائية functionalized RGD-كأداة للتطبيقات العلاجية

نقدم بروتوكولا لتخليق الهلاميات المائية الوظيفية RGD كأجهزة لتوصيل الخلايا والأدوية. يتضمن الإجراء إضافة حلقية محفزة من ألكين أزيد محفز بالنحاس (CuAAC) بين حمض البولي أكريليك المعدل بالألكين (PAA) ومشتق RGD-azide. يتم تشكيل الهلاميات المائية باستخدام التكثيف المتعدد بمساعدة الميكروويف ويتم فحص خصائصها الفيزيائية والكيميائية.

الهدف العام لهذه المنهجية هو تصنيع الهلاميات المائية لتطبيقات هندسة الأنسجة بسهولة بالغة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال هندسة الأنسجة ، مثل إمكانية الحفاظ على صلاحية عالية للخلايا في أنظمة زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه باستخدام رد فعل سريع ، يمكننا بسهولة تعديل أنظمة الهيدروجيل لتحسين قدرتها على الحفاظ على الخلية قابلة للحياة.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج إصابة الحبل الشوكي لأن الخلايا المحملة داخل السقالة يمكنها إعادة بناء الأنسجة التالفة. لهذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للعلاجات الخلوية كطب تجديدي وآثارها في العديد من المنهجيات. يمكن أيضا تطبيقه في العديد من الأنظمة الأخرى مثل العظام والقلب والغضاريف.

لتصنيع مشتق RGD-azide ، قم بإذابة 50 ملليغرام من RGD في مليلتر واحد من هيدروكسيد الصوديوم المولاري. ثم قم بإذابة 24 ملليغرام من كلوريد 4-أزيدوبوتانويل في ملليلترين من رباعي هيدروفوران. أضف كل محلول RGD إلى محلول كلوريد 4-أزيدوبوتانويل عند صفر درجة مئوية بالتنقيط.

يعاد إلى درجة حرارة الغرفة ويقلب طوال الليل. أضف ملليلتر واحد من حمض حمض الهيدروكلوريك المولاري. قم بإزالة المذيب تحت ضغط منخفض باستخدام مبخر دوار.

قم بتمييز المنتج الذي تم الحصول عليه عن طريق التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي للبروتون ، وإذابة العينة في أكسيد الديوتيريوم أو D2O. لإجراء تعديل ألكين PAA ، قم بإذابة 200 ملليغرام من محلول PAA بوزن 35٪ في 15 مل من الماء المقطر. أضف 15.4 ملليغرام من بروبارجيلامين هيدروكلوريد.

ثم قم بإذابة 42.8 ملليغرام من HOBt في 14 مل من نسبة واحد إلى واحد من محلول الماء المقطر الأسيتونيتريل عن طريق التسخين إلى 50 درجة مئوية. أضف كل محلول HOBt إلى محلول PAA في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف 53.6 ملليغرام من EDC إلى خليط التفاعل.

استخدم حمض الهيدروكلوريك المولي لضبط الرقم الهيدروجيني على 5.5 وحرك نظام التفاعل طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإذابة 11.2 جراما من كلوريد الصوديوم في لترين من الماء المقطر. ثم أضف 200 ميكرولتر من 37٪ الوزن بالوزن HCL.

غسيل الكلى بالمحلول باستخدام غشاء بقطع الوزن الجزيئي 3.5 كيلو دالتون. إجراء غسيل الكلى لمدة ثلاثة أيام. قم بتغيير محلول غسيل الكلى يوميا ب لترين من الماء المقطر الطازج الذي يحتوي على 200 ميكرولتر بوزن 37٪ من الوزن HCL.

قم بتخزين المحلول النهائي عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. توصيف البوليمر الوظيفي بواسطة التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي للبروتون ، وإذابة العينة في D2O. لتصنيع بوليمر PAA-RGD ، قم بإذابة 78 ملليغرام من الألكين المعدل PAA في 10 ملليلتر من الماء المقطر.

ثم قم بإذابة 25 ملليغرام من مشتق RGD-azide في خمسة ملليلتر من رباعي هيدرافوران. أضف كل محلول RGD إلى المحلول البوليمري. بعد ذلك ، أضف 2.2 ملليغرام من يوديد النحاس.

و 2.2 ملليغرام من أسكوربات الصوديوم. قم بإعادة الخليط الناتج طوال الليل عند 60 درجة مئوية مع التحريك. يبرد الخليط إلى 25 درجة مئوية.

لغسيل الكلى للمحلول ، قم بإذابة 11.2 جراما من كلوريد الصوديوم في لترين من الماء المقطر وأضف 200 ميكرولتر بوزن 37 بالمائة من وزن HCL. إجراء غسيل الكلى لمدة ثلاثة أيام. قم بتغيير محلول غسيل الكلى يوميا ب لترين من الماء المقطر الطازج الذي يحتوي على 200 ميكرولتر بوزن 37٪ من الوزن HCL.

ثم ضع المحلول النهائي عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. قم بتمييز وتخزين بوليمر PAA-RGD الناتج كما هو الحال مع مكوناته. امزج 40 ملليغرام من الكربومر و 10 ملليغرام من المحلول الملحي الوظيفي في تسعة ملليلتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات في درجة حرارة الغرفة حتى الذوبان الكامل.

أضف 400 ملليغرام من PEG إلى المحلول واستمر في التقليب لمدة 45 دقيقة. أوقف التقليب واترك النظام يستقر لمدة 30 دقيقة. ثم استخدم هيدروكسيد الصوديوم المولي لضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4.

إلى خمسة ملليلتر من الخليط الذي تم الحصول عليه ، أضف 25 ملليغرام من مسحوق الاغاروز. قم بإشعاع النظام بإشعاع الميكروويف عند 500 واط لمدة 30 ثانية إلى دقيقة واحدة حتى الغليان. وتسخين المحلول كهرومغناطيسيا إلى 80 درجة مئوية.

اترك الخليط معرضا لدرجة حرارة الغرفة حتى تنخفض درجة حرارته إلى 50 درجة مئوية. ثم أضف خمسة ملليلتر من PBS للحصول على محلول بنسبة حجمية واحدة إلى واحدة. قم بإعداد صفيحة متعددة الآبار 12 تحتوي على أسطوانات فولاذية بقطر 1.1 سم.

خذ 500 ميكرولتر من المحلول وضعها في كل أسطوانة فولاذية. اترك الطبق في حالة راحة لمدة 45 دقيقة حتى يكتمل الهلام للنظام. قم بإزالة الأسطوانات باستخدام ملقط من الفولاذ المقاوم للصدأ للحصول على الهلاميات المائية.

راجع بروتوكول النص لتوصيف الخصائص الفيزيائية والكيميائية للهلاميات المائية الوظيفية RGD. يشارك Carbomer 974P و PAA-RGD و PEG ، جنبا إلى جنب مع agarose ، في تكثيف متعدد عشوائي إحصائي بعد تشعيع الميكروويف. تتفاعل مجموعات الهيدروكسيل الموجودة في PEG و agarose مع مجموعات الكربوكسيل الموجودة في Carbomer 947P و PAA-RGD لتشكيل الهلاميات المائية ACPEG-RGD.

بالنظر إلى الخصائص الريولوجية ، وجد أن معامل التخزين أعلى بترتيب واحد تقريبا من معامل الخسارة ، مما يشير إلى مادة مرنة وليست لزجة. علاوة على ذلك ، من الواضح أن سلوك الهيدروجيل يهيمن عليه معامل المرونة عند قيم الإجهاد المنخفضة. يظهر الفحص المجهري الإلكتروني الماسح مورفولوجيا عينة هيدروجيل وظيفية RGD وهيدروجيل بدون وظيفية.

كشف كلا الهلاميين المائي أنهما يمتلكان بنية متشابكة للغاية من المسام المترابطة ، مع بعض المسام الكبيرة التي تحتوي على مسام صغيرة وبعض الشبكات الشظوية على جدران المسام. تشير الخصائص المماثلة إلى أن وجود RGD لا يغير شبكة البوليمر. بعد هذا التطور ، مهدت هذه التقنية الطريق للبحث في مجال هندسة الأنسجة لاستكشاف استقرار أنظمة زراعة الخلايا هذه في العديد من الأمراض الأخرى.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشغيل الهلاميات المائية. تحسين قدرتها على الحفاظ على الخلايا الجذعية القابلة للحياة.