إجراءات التكيف مختبر تطور الكائنات الدقيقة باستخدام ناظم كيميائي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تمكين الكائنات الحية الدقيقة من التطور في ظروف المختبر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء الدقيقة ، مثل علاقات وظائف الغدة الكظرية ، واستجابات الإجهاد ، وهندسة التمثيل الغذائي ، وبالطبع التطور. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الاختيار المستمر للسليل الأكثر طلبا في ظل ظروف معملية محددة.

ابدأ هذا الإجراء بإعداد المعدات ، بالإضافة إلى الوسط الأولي ، ومتوسط الإجهاد ، ووسط الضغط العالي ، كما هو موضح في بروتوكول النص. تلقيح مستعمرة واحدة أو بكتريا قولونية من النوع البري في أنبوب اختبار سعة 15 مليلتر يحتوي على أربعة ملليلتر من الوسط الأولي. احتضان أنبوب الاختبار في حاضنة اهتزاز لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة.

احتضان برطمان الكيموسات الذي يوفر التهوية والتحريك عند 37 درجة مئوية لمدة ست ساعات. بعد الحضانة ، قم بتوصيل نهاية أنبوب السيليكون من المضخات إلى جرة chemostat. انقل ملليلتر واحد من ما قبل الزراعة بشكل معقم إلى جرة chemostat.

ابدأ مضخة المخرج واجمع الثقافة في المرحلة الأسية. تحقق من الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر من الثقافة من أنبوب المخرج. ثم ابدأ مضخة المدخل.

تحقق من الكثافة البصرية للثقافة على بعد 600 نانومتر من أنبوب المخرج كل 24 ساعة. بعد تشغيل العلاج الكيميائي لمدة 96 ساعة ، وهو معدل دوران كامل 9.6 ، استبدل الخزان بأقل تركيز لوسط الضغط العالي. عندما تقوم باستبدال الخزان بوسط إجهاد أعلى ، قد تصاب الخلايا بالصدمة.

إذا كانت كثافة الخلية منخفضة جدا ، فتوقف عن تغذية وسط الضغط العالي لبعض الوقت لاستعادة كثافة الخلية. إذا كانت الكثافة البصرية أقل من 0.2 ، فقم بإيقاف مضخة مدخل التغذية لمدة ست ساعات. أعد تشغيل مضخة المدخل وتأكد من أن الكثافة البصرية تزيد عن 0.2.

قم بزيادة تركيز المجهد تدريجيا عن طريق التغيير التدريجي إلى خزان يحتوي على تركيز أعلى من الضغوط. خذ عينات من الثقافة المتكيفة كلما وصلت إلى مرحلة التكيف مع الإجهاد وقم بتخزينها لمزيد من التحليل الجيني. لتخزين العينات ، امزج عينة الثقافة 0.5 مل مع 0.5 مل من محلول الجلسرين المعقم بنسبة 80٪ وقم بتخزينها عند 80 درجة مئوية.

قم بإعداد 1.6٪ وسط لوحة يحتوي على نفس المجهد بنفس التركيز كما في الوسط. لوحة 0.1 مل من ثقافة المخرج من chemostat وتحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. بعد الحضانة ، اختر مستعمرات مفردة من اللوحة باستخدام عود أسنان معقم وقم بتلقيحها في أنابيب اختبار سعة 15 مليلتر تحتوي على نفس الإجهاد وبنفس التركيز المتوسط كما هو الحال في العلاج الكيميائي.

احتضن لمدة ست ساعات. انقل ملليلترا واحدا من مرق الاستزراع إلى قارورة إرلينماير سعة 250 مليلتر تحتوي على 50 مل من المتوسط. احصد 0.5 مل من مرق الاستزراع كل ساعة وقم بقياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر.

قارن معدل نمو السلالة المتكيفة بمعدل السلالة البرية بالنظر إلى الضغوط. تم تطوير سلالة الإشريكية القولونية من النوع البري في حالة إجهاد عالي السكسينات لمدة 270 يوما ، وهو ما يتوافق مع ما يقرب من 930 جيلا. كلما تمت إضافة إجهاد سكسينات أعلى ، تم خفض تركيز الكتلة الحيوية على الفور ثم استعادته.

يظهر هنا رسم تخطيطي للكيميوستات مع متحور متسامح مع الإجهاد السكسينات العالي. يتم غسل معظم الخلايا البرية في ظل ظروف الإجهاد وينمو المتحور أكثر. في النهاية ، يزداد عدد سكان السليل المتحور.

يتم اختيار الطفرات الثانية والثالثة باستمرار والسيطرة على العلاج الكيميائي وتهيمن عليه في النهاية. يوضح هذا الشكل أن السلالة المتكيفة نمت دون تأخير في ظل ظروف الإجهاد العالي السكسينات ، في حين أن السلالة البرية لم تفعل ذلك. يمكن تطبيق استراتيجية مماثلة على تطور المختبر التكيفي باستخدام chemostat مع مجموعة متنوعة من الضغوطات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اكتساب الكائنات الحية الدقيقة وتطويرها في ظل ظروف محددة. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في غضون شهرين. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر عدم غسل الخلايا الكيميائية عن طريق إضافة الكثير من الضغط في وقت واحد وتذكر التحقق من الكثافة البصرية كل يوم.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق مثل تحليل الجينوم وتحليل النسخ من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل الطفرة التي تساهم في تطور تحمل الإجهاد؟