إجراءات التكيف مختبر تطور الكائنات الدقيقة باستخدام ناظم كيميائي

الهدف العام من هذا الإجراء هو تمكين كائن مجهري من التطور في ظروف مختبرية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال علم الأحياء الدقيقة، مثل علاقات وظائف القشرة الكظرية، والاستجابات للإجهاد، والهندسة الأيضية، وبالطبع، التطور. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في الانتقاء المستمر للسليل الأكثر تكيفاً تحت ظروف مختبرية محددة.

ابدأ هذا الإجراء بتجهيز المعدات، بالإضافة إلى الوسط الأولي، ووسط الإجهاد، ووسط الإجهاد العالي، كما هو موضح في البروتوكول النصي. قم بتلقيح مستعمرة واحدة من سلالة E.coli البرية في أنبوب اختبار سعة 15 مل يحتوي على 4 مل من الوسط الأولي. حضن أنبوب الاختبار في حاضنة هزازة لمدة 12 ساعة عند 37 °C وبسرعة 220 rpm.

قم بتحضين وعاء الكيموستات مع توفير التهوية والتقليب عند 37 درجة مئوية لمدة ست ساعات. بعد التحضين، قم بتوصيل نهاية أنابيب السيليكون القادمة من المضخات بوعاء الكيموستات بطريقة معقمة. انقل 1 مللي لتر من المزرعة الأولية إلى وعاء الكيموستات بطريقة معقمة.

قم بتشغيل مضخة المخرج وجمع المزرعة في طور النمو الأسي. افحص الكثافة الضوئية للمزرعة عند 600 نانومتر من أنبوب المخرج. بعد ذلك، قم بتشغيل مضخة المدخل.

افحص الكثافة الضوئية للمزرعة عند 600 نانومتر من أنبوب المخرج كل 24 ساعة. بعد تشغيل الـ chemostat لمدة 96 ساعة، وهو ما يعادل 9.6 دورة كاملة، استبدل الخزان بوسط الإجهاد العالي ذي التركيز الأدنى. عند استبدال الخزان بوسط إجهاد أعلى، قد تتعرض الخلايا لصدمة.

إذا كانت كثافة الخلايا منخفضة للغاية، توقف عن إمداد وسط الإجهاد الأعلى لفترة من الوقت لاستعادة كثافة الخلايا. وإذا كانت الكثافة الضوئية أقل من 0.2، أوقف مضخة مدخل التغذية لمدة ست ساعات. أعد تشغيل مضخة المدخل وتحقق من أن الكثافة الضوئية تتجاوز 0.2.

قم بزيادة تركيز عامل الإجهاد تدريجياً من خلال الانتقال المتدرج إلى خزان يحتوي على تركيز أعلى من عامل الإجهاد. خذ عينات من المزرعة المتكيفة كلما وصلت إلى مرحلة مفصلية في التكيف مع الإجهاد، وقم بتخزينها لإجراء المزيد من التحاليل الجينومية. ولتخزين العينات، اخلط عينة المزرعة بحجم 0.5 milliliter مع 0.5 milliliters من محلول glycerol بنسبة 80% معقم، وخزنها عند 80 degrees celsius.

قم بتحضير وسط Agar تفريخي بتركيز 1.6% يحتوي على عامل الإجهاد نفسه وبنفس التركيز الموجود في الوسط. قم بنثر 0.1 milliliters من المزرعة الخارجة من الكيموستات (chemostat) وحضنها عند 37 degrees celsius لمدة 16 ساعة. بعد الحضن، قم باختيار مستعمرات مفردة من الطبق باستخدام عود أسنان معقم، ثم قم بتلقيحها في أنابيب اختبار سعة 15 milliliter تحتوي على عامل الإجهاد نفسه وبنفس تركيز الوسط المستخدم في الكيموستات.

يُحضن المزيج لمدة ست ساعات. يُنقل 1 mL من مرق المزرعة إلى دورق إرلنماير سعة 250 mL يحتوي على 50 mL من الوسط الغذائي. يتم جمع 0.5 mL من مرق المزرعة كل ساعة وقياس الكثافة الضوئية عند 600 nm.

قارن معدل نمو السلالة المتكيفة بمعدل نمو السلالة البرية في ظل وجود العامل المجهد. لقد خضعت سلالة E.coli البرية للتطور في ظروف إجهاد عالية من السكسينات لمدة 270 يوماً، وهو ما يعادل 930 جيلاً تقريباً. وكلما تمت إضافة إجهاد سكسينات أعلى، انخفض تركيز الكتلة الحيوية على الفور ثم استعاد مستواه.

يظهر هنا مخطط تخطيطي للمفاعل الكيميائي (chemostat) مع طفرة تتحمل الإجهاد العالي بالسوكسينات. يتم غسل معظم خلايا النوع البري تحت ظروف الإجهاد وتنمو الطفرة بشكل أكبر، مما يؤدي في النهاية إلى زيادة تعداد نسل هذه الطفرة.

يتم اختيار الطفرتين الثانية والثالثة باستمرار، وفي النهاية تهيمنان على جهاز الكيموستات. يوضح هذا الشكل أن السلالة المتكيفة نمت دون تأخير في ظل ظروف إجهاد عالية من السكسينات، بينما لم تفعل السلالة البرية. يمكن تطبيق استراتيجية مماثلة للتطور المختبري التكيفي باستخدام جهاز كيموستات مع تنويع عوامل الإجهاد.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحصيل وتطوير الكائن الحي الدقيق تحت ظروف محددة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون شهرين. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر عدم غسل خلايا جهاز الكيموستات عن طريق إضافة قدر كبير من الإجهاد دفعة واحدة، وتذكر فحص الكثافة الضوئية يومياً.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق مثل تحليل الجينوم وتحليل الترانسكريبتوم للإجابة على أسئلة إضافية، مثل: ما هي الطفرة التي تساهم في التطور المقاوم للإجهاد؟