تعداد الخلايا الجذعية العصبية باستخدام نسيلي فحوصات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تعداد تردد الخلايا الجذعية العصبية في مجموعة معينة باستخدام تكوين الكرات العصبية والتمايز تحت ظروف استنساخية. تمتلك هذه الطريقة استخدامات رئيسية في مجال الخلايا الجذعية العصبية، مثل تقييم واسمات الخلايا الجذعية العصبية المرشحة، وتنقية الخلايا الجذعية العصبية، والتمييز بين الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلفية العصبية. وتتمثل مزايا هذه الطريقة في أنها تستغرق 13 يوماً للتنفيذ، وهي مدة أقصر من الطرق الحالية المستخدمة لتعداد تردد الخلايا الجذعية العصبية، كما أنها تُجرى تحت ظروف استنساخية.

لبدء هذا الإجراء، في اليوم الأول، يتم تحضير وسط نمو الخلايا العصبية الجذعية (NSC) عن طريق دمج وسط DMEM F12 مع B27 وEGF وBFGF والبنسلين ستريبتومايسين. بعد ذلك، يتم تفكيك الكرات العصبية للفئران في المرحلة الجنينية E14.5 في 1 mL من وسط نمو NSC و1 mL من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 0.05 normal لمدة سبع دقائق في درجة حرارة الغرفة. يتم سحب الخلايا وإطلاقها بواسطة الماصة من حين لآخر لإبقائها في حالة تعليق، ثم يضاف 1 mL من حمض الهيدروكلوريك بتركيز 0.05 normal لمعادلة القلوي.

بعد ذلك، قم بإجراء عد للخلايا باستخدام صبغة trypan-blue ومقياس كرات الدم (hemocytometer). عقب ذلك، قم باستزراع خلايا كرويات عصبية مفردة من فئران في المرحلة الجنينية E14.5 بكثافة 50 خلية لكل ملليلتر أو أقل في 100 µL من وسط نمو الخلايا العصبية الجذعية (NSC) في طبق يحتوي على 96 بئراً. يتم تحضين الخلايا عند 37 °C و5% CO2 لمدة أسبوع واحد لتوليد كرويات عصبية نسيلية.

لاستزراع الكرات العصبية من أجل الحصول على الوسط المكيّف، قم في اليوم الثالث بتفكيك الكرات العصبية للفئران في المرحلة E14.5 وازرع الخلايا المفردة بكثافة 20,000 خلية لكل millilter في 10 milliliters من وسط نمو الخلايا الجذعية العصبية (NSC growth medium) في طبق زراعة بقطر 10 centimeter. بعد ذلك، قم بتحضين الخلايا عند 37 °C و5% CO2 لمدة خمسة أيام لإنتاج كرات عصبية مستزرعة بكميات كبيرة. وفي اليوم الثامن، قم بتحضير محلول الطلاء عن طريق خلط 700 µL من 0.01% poly-L-lysine، و70 µL من laminin بتركيز 1 mg/mL، وإضافة 6,230 µL من PBS.

بعد ذلك، قم بطلاء طبق زراعة بقطر 10 centimeter بسبعة ملليلتر من محلول poly-L-lysine laminin لمدة ساعتين عند 37 °C. وباستخدام ماصة سيرولوجية سعة 10 milliliter، انقل جميع الكرات العصبية المستزرعة إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 millimeter. قم بطرد الكرات العصبية مركزياً عند 171 ×g لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة، ثم تخلص من السائل الطافي تماماً.

بعد ذلك، قم بتحضير وسط تمايز الخلايا الجذعية العصبية (NSC) عن طريق دمج وسط DMEM F12 مع B27 وFBS. أضف 10 milliliters من وسط تمايز NSC إلى الكرات العصبية، واستخدم الماصة للتحريك للأعلى والأسفل عدة مرات لإعادة تعليق الكرات العصبية. ثم قم بشفط poly-L-lysine laminin من طبق الزرع الذي يبلغ قطره 10 centimeter واغسله مرة واحدة باستخدام 10 milliliters من PBS.

انقل جميع الكرات العصبية إلى طبق زراعة بقطر 10 سنتيمتر مغطى بـ poly-L-lysine laminin، واتركها في الحاضنة طوال الليل عند 37 °C و5%CO2 لكي تلتصق الكرات العصبية بالطبق. وفي اليوم الثامن، قم بتعداد عدد الكرات العصبية المتكونة في كل بئر باستخدام المجهر، ثم قم بتغطية كل بئر من غطاء شريحة مكون من 50 بئراً بـ 10 µL من محلول طلاء poly-L-lysine laminin لمدة ساعتين عند 37 °C. بعد ذلك، جهز ثلاثة أنابيب طرد مركزي مخروطية سعة 50 mL تحتوي كل منها على 30 mL من PBS.

باستخدام ملقط معقم، قم بإزالة غطاء الشريحة ذو الغرف المكون من 50 بئراً والمطلي، ثم اغمس غطاء الشريحة في أنبوب PBS الأول، يليه الأنبوب الثاني، ثم الثالث لغسل محلول الطلاء. بعد ذلك، قم بشفط أي سائل متبقٍ من آبار غطاء الشريحة. انقل جميع الأوساط والكرات العصبية بلطف من كل بئر في طبق الـ 96 بئراً إلى طبق زراعة واحد بقطر 10 سنتيمتر.

تأكد من التقاط كرة عصبية واحدة فقط في كل مرة عن طريق ضبط عمود الماصة على 2 µL، ثم التقط عينة من كرة عصبية تحت المجهر باستخدام ماصة دقيقة P10 مزودة بطرف ماصة سعة 10 µL. يمكن التقاط الكرات العصبية تحت المجهر، أو داخل غطاء تدفق صفائحي، أو على سطح طاولة المختبر. بعد ذلك، انقل الكرة العصبية إلى مركز إحدى آبار غطاء الشريحة المكون من 50 بئراً والمطلي مسبقاً.

كرر الإجراءات حتى تحتوي كل بئر من غطاء الشريحة ذي الغرف على كرة عصبية (neurosphere). بعد ذلك، أضف 10 µL من وسط تمايز الخلايا الجذعية العصبية (NSC) إلى كل بئر من غطاء الشريحة ذي الغرف. ضع غطاء الشريحة ذو الغرف في طبق زراعة بقطر 10 cm.

يمكن وضع ما يصل إلى شريحتي غطاء ذات حجرات في طبق سعة 10 سنتيمتر. قم بنقل PBS باستخدام الماصة على طول حواف الطبق لمنع جفاف وسط تمايز NSC. قم بحضن شريحة الغطاء ذات الحجرات طوال الليل عند 37 درجة مئوية، و5%CO2.

في اليوم التاسع، يتم نقل الوسط المكيف من الكرات العصبية المستزرعة بكميات كبيرة إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 milliliter. وباستخدام حقنة معقمة سعة 20 milliliter، يتم تمرير الوسط المكيف عبر مرشح بمسامية 0.2 micrometer لإزالة أي خلايا أو حطام خلوي. بعد ذلك، يتم نقل الوسط المكيف المُرشح مرة أخرى إلى طبق الاستزراع بقطر 10 centimeter.

بعد ذلك، وباستخدام ملقط معقم، ضع غطاء الشريحة ذو الغرفة برفق فوق الوسط المُهيأ بشكل مقلوب، بحيث تكون الكرات العصبية للعينة موجهة نحو الأسفل. يتم تحضين غطاء الشريحة ذو الغرفة لمدة ثلاثة أيام عند 37 درجة Celsius، و5%CO2. وفي اليوم 12، قم بإزالة غطاء الشريحة ذو الغرفة برفق من طبق الزرع قياس 10 سنتيمتر باستخدام ملقط معقم.

اغمس شريحة الغطاء برفق في محلول PBS لغسل الوسط المُكيَّف. بعد ذلك، قم بإزالة الحشية السيليكونية من شريحة الغطاء، ونفذ هذه الخطوة برفق وببطء لتجنب كسر شريحة الغطاء. لاحظ الجانب الذي تلتصق به الكريات العصبية المتمايزة.

بعد ذلك، يتم سحب 1 mm من البارافورمالدهيد بنسبة 4% بواسطة الماصة ووضعه على قطعة من فيلم البارافين مقصوصة بحجم غطاء الشريحة. ضع غطاء الشريحة برفق فوق فيلم البارافين بحيث تكون الكرات العصبية متجهة لأسفل وملامسة للبارافورمالدهيد، ثم ثبت الكرات العصبية لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وفي هذه الخطوة، تم اختيار كرات عصبية مفردة وتمايزها في غطاء شريحة ذي غرف مكونة من 50 بئراً لمدة ثلاثة أيام.

هذه صورة تمثيلية لكرة عصبية ثلاثية القدرات مصبوغة بـ dapi وموسومة مناعياً لـ GFAP و TUJ1 و O4. تظهر هذه الصورة تراكب dapi و GFAP و TUJ1 و O4. يُستخدم هذا البروتوكول لتقييم قدرة LeX، وهو واسم معروف للخلايا الجذعية العصبية (NSC)، على إثراء الخلايا الجذعية العصبية. يوضح هذا الرسم البياني النسبة المئوية للكرات العصبية أحادية القدرة، وثنائية القدرة، وثلاثية القدرة الناتجة عن الخلايا الموجبة لـ LeX والخلايا السالبة لـ LeX. وتنتج الخلايا الموجبة لـ LeX كرات عصبية ثلاثية القدرات بشكل ملحوظ أكثر من الخلايا السالبة لـ LeX.

يوضح هذا الجدول أن تردد الخلايا الجذعية العصبية (NSC) للخلايا الموجبة لـ LeX والخلايا السالبة لـ LeX قد تم حسابه كحاصل ضرب تردد تكوين الوحدات (NFU) في النسبة المئوية للكرات العصبية ثلاثية القدرة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استزراع الكرات العصبية وتمايزها تحت ظروف نسيليّة لتعداد تردد الخلايا الجذعية العصبية. عند تنفيذ هذه الطريقة، من المهم استخدام أوساط نمو وتمايز مُحضرة حديثاً ومحلول طلاء مُحضر حديثاً لضمان ظروف نمو وتمايز مثالية للكرات العصبية.

بمجرد إتقان هذه الطريقة، يمكن تنفيذها في غضون 13 يوماً، وهي فترة زمنية أقصر مقارنة بالطرق الحالية المستخدمة لتعداد تكرار الخلايا الجذعية العصبية. ويمكن استخدام هذه الطريقة جنباً إلى جنب مع الطرق الحالية، مثل مقايسة خلايا تكوين المستعمرات العصبية، لإثراء الخلايا الجذعية الأحدث وتحديد واسم محدد للخلايا الجذعية العصبية.