توجه التغليف البروتين داخل الخارجي غشاء الحويصلات من كولاي: تصميم وإنتاج وتنقية
November 16th, 2016
الهدف العام من هذا الإجراء هو تنقية وتوصيف حويصلات الغشاء الخارجي البكتيرية المملوءة بالإنزيم لاستخدامها ككواشف تحفيزية في المختبر. تسمح تقنية عزل الإنزيم هذه بحصاد OMVs البكتيرية من وسط الاستزراع ثم استخدامها لإجراء التحفيز الخالي من الخلايا لمركب الفوسفات العضوي. تعمل العبوة الموجهة داخل OMVs البكتيرية على تحسين استقرار الإنزيم بشكل كبير على مجموعة من ظروف التفاعل والتخزين على عكس التقنيات التقليدية التي غالبا ما تؤدي إلى فقدان تدريجي ومستمر لنشاط الإنزيم.
تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو تغليف البروتينات ذات الصلة في مجالات متعددة ، مثل تطوير العلاجات أو المعالجة أو تطوير أنظمة تحفيزية خالية من الخلايا. في حين أن هذا البروتوكول يفصل تنقية OMVs من الإشريكية القولونية ، يمكن بسهولة استخدام التقنيات مع تعديل استراتيجية التغليف لتنقية OMV من مجموعة متنوعة من مزارع الخلايا الميكروبية. بعد توليد حويصلات الغشاء الخارجي أو OMVs في البكتيريا وفقا لبروتوكول النص ، قم بالطرد المركزي لوسط الثقافة البكتيرية السليم عند 7،000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
قم بإزالة المادة الطافية وحفظها ، مع الحرص على عدم إزعاج حبيبات الخلية. بعد ذلك ، ضع المادة الطافية في دورة ثانية للتأكد من إزالة جميع البكتيريا من الوسط. لإزالة مجاميع البروتين والمواد الخلوية الكبيرة من وسط الاستزراع المحفوظ ، ارسم المحلول في حقنة معقمة من 10 إلى 50 ملليلترا.
قم بتوصيل مرشح 0.45 ميكرون لإغراء نهاية المحقنة. ثم اضغط على المكبس واجمع التدفق في أنبوب جديد. بدلا من ذلك ، قم بتصفية وسط الثقافة بالفراغ عن طريق نقله إلى جهاز ترشيح معقم.
قم بتوصيل الوحدة بمضخة تفريغ أو شفاط بالوعة لتوليد الشفط. انقل الوسط المصفى إلى وعاء جديد. لعزل OMVs ، قم بنقل وسط الاستزراع المفلتر إلى أنابيب الطرد المركزي الفائق.
قم بتدوير الوسط عند حوالي 150،000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات باستخدام دوار يتوافق مع الأنابيب المستخدمة. مباشرة بعد الطرد المركزي الفائق لتجنب فقدان كتلة الحبيبات ، قم بصب وسط الاستزراع المستنفد من OMV من حبيبات OMV ذات اللون البني قليلا والتي قد تكون أو لا تكون مرئية بالعين. لا يجوز التصاق حبيبات OMV المتكونة بعد الطرد المركزي إلا بشكل فضفاض بحويصلة الطرد المركزي.
يجب توخي الحذر عند الصب لضمان عدم إزاحة الحبيبات وفقدانها. احتفظ بالمادة الطافية لتشتت الضوء الديناميكي في وقت لاحق للتحقق من استنفاد جسيمات OMV بالكامل من الوسط. أضف 0.5 إلى مليلتر واحد من PBS المصفى المعقم أو PH 7.4 أو أي مخزن مؤقت مفلتر آخر على النحو الذي تحدده الاحتياجات أو الظروف التجريبية ، إلى الحبيبات واتركها تحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
ثم قم بخلط محلول OMV المنقى بعناية لضمان إذابة الحبيبات بالكامل. لتحديد توزيع حجم OMV ، افتح برنامج تتبع الجسيمات النانوية DLS للأداة المستخدمة. قم بتشغيل المجهر وتنظيف جميع الأسطح الموجودة على المجهر ووحدة تتبع الجسيمات النانوية.
باستخدام حقنة معقمة سعة مليلتر واحد ، أضف ما يقرب من 0.5 مل من عينة OMV مباشرة إلى نافذة عرض جهاز تتبع الجسيمات من خلال التركيب السفلي ، مع الحرص على تغطية نافذة العرض بأكملها دون حقن أي فقاعات هواء في النظام. ضع وحدة تتبع الجسيمات النانوية على مرحلة المجهر وقم بتشغيل الليزر. ثم انقر فوق الالتقاط في البرنامج.
اضبط تركيز المجهر والمرحلة لتصور الجسيمات على شاشة المعاينة الموجودة في نافذة البرنامج. اضبط غالق الكاميرا وكسب الكاميرا حتى يتم تصور الجسيمات الساطعة بوضوح على خلفية داكنة. اضبط مدة الالتقاط على 60 ثانية، ثم انقر على تسجيل.
عند المطالبة، أدخل عينة درجة حرارة الجهاز، وقم بتسمية العينة، واحفظ بيانات الفيديو عند الانتهاء من كل تشغيل في مجلد مخصص من قبل المستخدم. احتفظ بجميع معلمات التحليل في وضع الاكتشاف التلقائي وانقر فوق تسلسل العملية. سجل توزيع حجم الجسيمات وتركيزها كجزيئات لكل مليلتر على النحو الذي يحدده البرنامج.
لتحديد محتوى بروتين OMV ، استخدم SDS-PAGE و Western Blots لتقييم إنتاج إنزيم نقاء OMV و SpyCatcher أو SC إلى SpyTag أو كفاءة الارتباط المتقاطع ST. من الضروري تأكيد التعبير عن الإنزيمات المستهدفة وبروتين المرساة. غالبا ما يكون التعبير عن البروتينات المؤتلفة غير ناجح لعدة أسباب ويجب تأكيد نجاح إنتاج البروتين قبل توصيف OMV.
لإجراء فحص نشاط الفوسفوتريستراز أو PTE ، أضف خمسة ميكرولترات من 1 إلى 1,000 تخفيف من الباراوكسون في مخزن CHES إلى خمسة ميكرولترات من OMVs المنقاة في 90 ميكرولتر من CHES. خذ قراءات الامتصاص عند 405 نانومتر و 348 نانومتر كل 20 ثانية لمدة ساعتين تقريبا من إجمالي وقت التفاعل لمراقبة تقدم منتج انهيار الباراوكسون الكروموجينيك p-nitrophenol. أخيرا ، قم بإجراء تحليل البيانات وفقا لبروتوكول النص.
تظهر هنا أمثلة على مورفولوجيا OMVs المنقاة من الإشريكية القولونية عبر SEM. يتراوح حجم OMVs من 50 إلى 250 نانومتر كما هو محدد باستخدام أجهزة تتبع الجسيمات. في هذا الرسم البياني ، يظهر تركيز OMV المطلق.
عندما تم تحويل N الطرفي OMP-A-ST مع PTE-SC في وجود أرابينوز و IPTG ، لوحظت زيادة كبيرة في إنتاج OMV مقارنة بالعينات الضابطة. تميز SDS-PAGE و Western Blots الموضحة هنا محتوى بروتين OMV وتعبير البروتين المؤتلف ل OMP-A-ST و OMP-A الأصلي و PTE-SC و OMP-A-ST-PTE-SC. في هذا الشكل ، تم تحديد مستويات التعبير الإجمالية ل PTE وكفاءة تغليف OMV في كريات الخلية ، وطاف UC ، وكريات UC OMV المنقاة من خلال قياسات السرعة الأولية باستخدام الباراوكسون كركيزة كروموجينيك.
هنا ، تم استخدام Triton X-100 للتحقق من انتقال الباراوكسون عبر طبقات OMV الثنائية السليمة. كان هناك اختلاف بسيط في النشاط مع أو بدون المنظف ، مما يشير إلى أن الباراكسون يمر بحرية عبر المسام الداخلية على OMV. أخيرا ، كما رأينا في هذه التجربة ، فإن البيانات الحركية PTE-SC مناسبة لمعادلة حركية إنزيم Michaelis-Menten القياسية ل N الطرفية OMP-A-ST التي تم تحويلها بشكل مشترك مع PTE-SC في وجود أرابينوز و IPTG و PTE-SC في وجود تنشيط أرابينوز.
بمجرد إجراء جميع التركيبات الجينية وتأكيدها ، يمكن إنجاز تغليف الإنزيم وتنقية OMV على مدار يومين. من الضروري اليوم الثالث تأكيد وتوصيف OMVs كلما تم تطوير بنية جديدة. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التحقق من تصنيفات السلامة لجميع المواد ومعدات الطرد المركزي.
بالإضافة إلى ذلك ، من المهم التحقق من نجاح كل خطوة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. يمكن استكمال خطوات التوصيف الموضحة هنا بخطوات أخرى لتأكيد تغليف الإنزيم ومورفولوجيا OMV. يمكن أن يختلف تركيز البروتين ومحتوى الدهون وتركيز LPS والعديد من الخصائص الأخرى باختلاف الحمولات وظروف التقريب وقد تؤثر على التطبيقات النهائية.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنقية وتوصيف OMVs المملوءة بالإنزيم بالإضافة إلى إجراء فحوصات أولية لتقييم نشاط شحنة الإنزيم. لا تنس أن العمل مع البكتيريا والكواشف الكيميائية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما استخدام الاحتياطات مثل تقنية التعقيم المناسبة ومعدات الحماية الشخصية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
الموجز
يحدد هذا البروتوكول إنتاج وتنقية وتطبيق الحويصلات الغشائية الخارجية المملوءة بالإنزيم (OMVs) المشتقة من البكتيريا. تعمل هذه الحويصلات الغشائية الخارجية على تعزيز استقرار الإنزيم، مما يجعلها مناسبة لتطبيقات مختلفة، بما في ذلك التحفيز بدون خلايا.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- الكيمياء الحيوية
- علم الأحياء الدقيقة
- تكنولوجيا الإنزيم
الخلفية
- الحويصلات الغشائية الخارجية (OMVs) هي جزيئات نانوية طبيعية تفرزها البكتيريا.
- يمكن أن تقوم الحويصلات الغشائية الخارجية بتغليف الإنزيمات، مما يحسن من استقرارها مقارنة بالطرق التقليدية.
- تسمح هذه التقنية باستخدام الحويصلات الغشائية الخارجية في تطبيقات متنوعة، بما في ذلك تطوير العلاجات وإعادة التأهيل البيئي.
- يركز البروتوكول على الحويصلات الغشائية الخارجية المستمدة من E. coli ولكن يمكن تعديله لاستخدامه مع مستنبتات ميكروبية أخرى.
هدف الدراسة
- لتنقية وتوصيف الحويصلات الغشائية الخارجية المملوءة بالإنزيم للاستخدامات التحفيزية في المختبر.
- لتعزيز استقرار الإنزيم لنشاط ممتد تحت ظروف متنوعة.
- لتمكين استكشاف إمكانات الحويصلات الغشائية الخارجية في مجالات متعددة مثل العلاجات والتحفيز.
الطرق المستخدمة
- حصاد الحويصلات الغشائية الخارجية للبكتيريا من وسط النمو.
- ترسيب الثقافات البكتيرية لعزلة الحويصلات الغشائية الخارجية.
- توصيف نشاط الإنزيم داخل الحويصلات الغشائية الخارجية.
- تطبيق الحويصلات الغشائية الخارجية في التحفيز بدون خلايا لمركبات الفوسفات العضوي.
النتائج الرئيسية
- تحسن الحويصلات الغشائية الخارجية بشكل كبير من استقرار الإنزيم مقارنة بتقنيات العزل التقليدية.
- يتم الاحتفاظ بنشاط الإنزيم على مدى مجموعة من ظروف التفاعل والتخزين.
- يسمح البروتوكول بالتنقية الفعالة للحويصلات الغشائية الخارجية من E. coli.
- تم تسليط الضوء على التطبيقات المحتملة في العلاجات وإعادة التأهيل البيئي.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول المطور طريقة موثوقة لإنتاج حويصلات غشائية خارجية مستقرة مملوءة بالإنزيم.
- يمكن أن تعمل الحويصلات الغشائية الخارجية كعوامل تحفيزية فعالة في تطبيقات كيميائية حيوية متنوعة.
- قد توسع الأعمال المستقبلية استخدام هذه التقنية لأنظمة ميكروبية أخرى.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Directed protein packaging into outer membrane vesicles (OMVs) enables stable enzyme delivery for cell-free catalytic systems, addressing instability challenges in recombinant protein production. This approach supports biopharma R&D by improving enzyme shelf-life and activity under variable conditions, reducing attrition in early-stage enzyme therapeutic and diagnostic development. The method provides a scalable, bacteria-derived nanoparticle platform for targeted payload delivery with applications in therapeutic enzyme replacement, bioremediation, and diagnostic reagent stabilization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of recombinant enzymes by maintaining activity through OMV encapsulation, reducing false negatives in target screening.
- Operational Value: Supports high-throughput assessment of enzyme variants by standardizing stability readouts across constructs.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a stable enzyme presentation format for consistent kinetic measurements in cell-free assays, improving assay reproducibility.
- Operational Value: Facilitates assay standardization by minimizing activity drift during screening campaigns, reducing need for frequent reagent re-preparation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables evaluation of enzyme therapeutics in physiologically relevant conditions by protecting cargo from proteolytic degradation.
- Operational Value: Supports formulation development for enzyme-based therapeutics by demonstrating enhanced stability under storage and transport stresses.
Pipeline & Workflow Integration
The OMV packaging method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization, enabling stable enzyme production for downstream screening and preclinical evaluation.
- Discovery Biology: Confirms target engagement and pathway modulation by preserving enzyme function during in vitro characterization.
- Screening: Delivers quantitative, stable enzyme outputs for dose-response analysis, improving hit-to-lead transition confidence.
- Analytics: Generates reliable activity data via paraoxon hydrolysis assays, enabling comparative assessment of enzyme variants.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by demonstrating enzyme stability in simulated biological conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for encapsulating diverse enzymes, reducing redevelopment effort across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in enzyme functionality by mitigating activity loss during assay execution.
- Operational Value: Improves reagent consistency and scalability through standardized OMV isolation and quantification protocols.
- Strategic Value: Reduces biological risk in enzyme therapeutic development by validating target modulation capacity early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of enzyme candidates based on demonstrated stability and catalytic efficiency.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, protein expression, and bacterial culture techniques.
- Depends on access to ultracentrifugation and nanoparticle tracking instrumentation for OMV isolation and characterization.
- Necessitates standardization of induction conditions (e.g., arabinose/IPTG) across teams to ensure reproducible vesiculation and packaging efficiency.
- Involves adaptation considerations for different enzyme sizes, solubilities, and anchoring strategies when extending to non-PTE cargos.
- Includes practical limitations such as variable OMV yield and potential aggregation during storage, requiring empirical optimization per enzyme target.
