إعداد وتسليم Microcrystals البروتين في المرحلة مكعب شحمي عن المسلسل الفيمتو ثانية البلورات

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعداد عينات من بلورات البروتين الغشائي في الطور المكعب الدهني لجمع بيانات علم البلورات التسلسلي في مصادر ليزر الإلكترون الخالية من السنكروترون والأشعة السينية. يجب أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا الهيكلية لبروتينات الغشاء ، مثل النقل والتنبيغ الفردي عبر الغشاء. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تتيح تحديد بنية بروتينات الغشاء في بيئتها الدهنية الأصلية في درجة حرارة الغرفة مع الحد الأدنى من استهلاك العينة وتلف إشعاعي ضئيل.

سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن المرحلة المكعبة الدهنية هي مادة لزجة تشبه الهلام يصعب التعامل معها بدون أدوات خاصة وخبرة سابقة. ابدأ هذا الإجراء بإعادة تكوين بروتينات الغشاء في المرحلة المكعبة الدهنية ، أو LCP ، باستخدام المحاقن رقم واحد ورقم اثنين ، كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد تشكيل LCP شفاف ومتجانس ، انقل العينة بأكملها إلى المحقنة رقم اثنين.

افصل المحقنة رقم واحد مع إبقاء قارنة التوصيل متصلة بالمحقنة رقم اثنين. قم بتوصيل إبرة قابلة للإزالة بحقنة نظيفة أخرى سعة 100 ميكرولتر ، تسمى المحقنة رقم ثلاثة. استنشق ما يقرب من 70 ميكرولترا من محلول الترسيب فيه.

افصل الإبرة عن المحقنة رقم ثلاثة مع الاحتفاظ بغلاف التفلون داخل المحقنة. قم بتوصيل المحاقن رقم اثنين ورقم ثلاثة من خلال قارنة التوصيل ، وتأكد من أن كرات التفلون في مكانها بشكل صحيح في كلتا المحاقن. قم بربط قارنة التوصيل بإحكام في موضعها بعناية.

قم بتوجيه المحاقن المقترنة عموديا ، مع وجود المحقنة رقم اثنين في الأسفل ، وحقن عينة LCP المحملة بالبروتين من المحقنة رقم اثنين في المحقنة رقم ثلاثة ببطء وثبات ، حتى تلامس سلسلة LCP مكبس المحقنة رقم ثلاثة. سيصل حجم LCP المحقون إلى حوالي 1/10 من حجم الترسيب الأولي في المحقنة رقم ثلاثة. تحقق من مستوى الصوت من خلال قراءة الميزان على كلا المحاقن.

ثم افصل المحقنة رقم اثنين. مقرنة التوصيل الآن فقط بالمحقنة رقم ثلاثة ، والتي تحتوي على العينة المغمورة في محلول الترسيب. استخدم Parafilm لإغلاق المحقنة رقم ثلاثة تماما ، بما في ذلك واجهة المكبس والحقنة ، ونهاية فتح قارنة التوصيل ، وصمولة الإبرة.

يمكن أن يتسبب الختم غير المكتمل خلال هذه الخطوة في تغيير ظروف الترسيب وتجفيف العينة. كرر حقن خطوات عينة LCP المحملة بالبروتين لإعداد التبلور في ست محاقن إضافية ، باستخدام ما مجموعه 50 ميكرولترا تقريبا من عينة LCP. قم بتخزين المحاقن محكمة الغلق في كيس بلاستيكي قابل للغلق مع واحد أو اثنين من مناديل التنظيف الخالية من الألياف المنقوعة بالماء للحماية من جفاف العينة.

أغلق الكيس وقم بتخزين المحاقن في حاضنة 20 درجة مئوية أثناء نمو البلورات. للكشف عن البلورات ، قم بإزالة المحاقن من الحاضنة لإصدار عينات LCP مباشرة داخل المحاقن كل 12 إلى 24 ساعة تحت مجهر استريو مع ضوء متقاطع. حدد البلورات على أنها جزيئات لامعة معبأة بإحكام ، أو ، في حالة حجم البلورة الأصغر ، كتوهج موحد من خيوط LCP.

أعد المحاقن محكمة الغلق إلى الكيس ، واحفظها على حرارة 20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. تعد خطوة المعايرة بالتحليل الحجمي للدهون ضرورية لامتصاص محلول الترسيب الزائد ومنع تجميد الدهون عند الحقن في شعاع الليزر الإلكتروني الخالي من الأشعة السينية. قبل حوالي ساعة من بدء جمع البيانات ، قم بإزالة المحاقن مع العينات من حاضنة 20 درجة مئوية.

حدد محاقنتين إلى أربع محاقن لدمج العينة بناء على مظهر بلوري مماثل وتشابه ظروف التبلور. قم بإزالة مانع تسرب Parafilm بعناية من المحاقن المحددة. قم بإزالة قارنة الحقنة ، وقم بتوصيل إبرة نظيفة قابلة للإزالة بأول حقنة محددة.

ادفع المكبس برفق وببطء للأمام للضغط على الترسيب من خلال الإبرة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. توخي الحذر في هذه الخطوة ؛ لأن تطبيق ضغط عال على المكبس يمكن أن يؤدي إلى إخراج بعض LCP المحمل بالكريستال جنبا إلى جنب مع محلول الترسيب ، مما يؤدي إلى فقدان جزئي أو كامل للعينة. أوقف المكبس عند إزالة معظم الترسيب وتراكم LCP عند مدخل الإبرة.

قم بإجراء هذه العملية للمحاقن الأخرى المحددة. لدمج عينات LCP الناتجة ، قم بتوصيل حقنتين معا من خلال قارنة توصيل نظيفة. اضغط على المكبس الموجود على حقنة واحدة لنقل العينة بأكملها من إحدى المحاقن إلى أخرى.

افصل المحقنة الفارغة. كرر هذه الخطوة لدمج كل مادة LCP المحملة بالكريستال في حقنة واحدة. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الترسيب.

أضف ما يقرب من خمسة ميكرولترات من 7.9 MAG أو دهون MAG المضيفة الأصلية ذات السلسلة الأقصر إلى حقنة فارغة. قم بتوصيل هذه المحقنة بالمحقنة بالعينة الموحدة من خلال مقرنة حقنة ، واخلطها بدلا من ذلك عن طريق الضغط على غطاسات المحقنة. كرر العملية حتى يتم امتصاص كل المحلول المتبقي وتشكيل LCP متجانس وشفاف.

انقل عينة LCP المختلطة بالكامل إلى حقنة واحدة ، وافصل المحقنة الفارغة. قم بتوصيل إبرة تحميل حاقن LCP بالمحقنة بالعينة الموحدة. قم بإخراج ما يقرب من ميكرولتر واحد من عينة LCP بعناية على شريحة زجاجية ، وقم بتغطيتها بقلة غطاء زجاجي.

اضغط برفق على زلة الغطاء لشطيرة العينة. التقط صورا لعينة LCP تحت مجهر استريو بأعلى تكبير ممكن ، باستخدام إضاءة المجال الساطع والمستقطبات المتقاطعة. إذا أمكن ، التقط صورا إضافية باستخدام مجهر الإزهار فوق البنفسجي وجهاز التصوير لتأكيد وجود بلورات دقيقة بروتينية في العينة.

تقدير حجم البلورة وكثافتها. ستعتمد الكثافة البلورية المثالية لتجربة جمع البيانات على حجم البلورة وقطر شعاع الأشعة السينية وقطر تيار LCP ، ويجب أن تؤدي إلى معدل إصابة بلورية يبلغ حوالي 10 إلى 40٪ أخيرا ، قم بتحميل حاقن LCP ، وقم بإجراء علم البلورات التسلسلي LCP ، أو جمع بيانات LCP SFX ، كما هو موضح في بروتوكول النص. تظهر هنا بلورات دقيقة لمستقبلات السيروتونين في مركب مع الإرغوتامين تم تصويرها باستخدام وضع مجهر المجال الساطع ، وتم تصويرها باستخدام وضع المجهر الضوئي المستقطب المتقاطع.

تم الحصول على بنية مركب الإرغوتامين لمستقبلات السيروتونين من خلال نهج LCP SFX. تظهر هنا بلورات دقيقة لمستقبلات الملساء في مركب مع السيكلوبامين تم تصويرها باستخدام وضع المجهر المتقاطع. تم الحصول على بنية مركب سيكلوبامين المستقبل من خلال نهج LCP SFX.

بمجرد إتقانه ، يمكن تنفيذ هذا الإجراء في أقل من ساعتين إذا تم تنفيذه بشكل صحيح. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لبنية أهداف البروتين الغشائي ، مع تعديل طفيف ، إلا أنه يمكن أيضا تطبيق البروتينات. يمتد تأثير هذه التقنية إلى اكتشاف الأدوية. لأن الهياكل عالية الدقة توفر قوالب ممتازة من تفاعلات بروتين Lignan القياسية وتساعد في تصميم أدوية أكثر كفاءة.