إعداد وتسليم Microcrystals البروتين في المرحلة مكعب شحمي عن المسلسل الفيمتو ثانية البلورات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير عينات من بلورات بروتينات غشائية في طور مكعب دهني لجمع بيانات البلورات المتسلسلة في مصادر السينكروترون وليزر الإلكترون الحر بالأشعة السينية. من شأن هذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال البيولوجيا التركيبية للبروتينات الغشائية، مثل النقل ونقل الإشارة عبر الغشاء. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تمكن من تحديد تركيب البروتينات الغشائية في بيئتها الدهنية الأصلية في درجة حرارة الغرفة، مع استهلاك أدنى للعينات وضرر إشعاعي مهمل.

سيواجه الأشخاص الذين يستخدمون هذه الطريقة لأول مرة بعض الصعوبات لأن الطور المكعبي الدهني عبارة عن مادة لزجة تشبه الهلام، ويصعب التعامل معها دون أدوات خاصة وخبرة مسبقة. ابدأ هذا الإجراء بإعادة تشكيل بروتينات الغشاء في الطور المكعبي الدهني (Lipidic Cubic Phase) أو LCP، باستخدام الحقنتين رقم واحد ورقم اثنين، كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. بعد تكوين LCP شفاف ومتجانس، انقل العينة بأكملها إلى الحقنة رقم اثنين.

افصل المحقنة رقم واحد مع إبقاء الوصلة متصلة بالمحقنة رقم اثنين. قم بتوصيل إبرة قابلة للإزالة بمحقنة نظيفة أخرى سعة 100 ميكرولتر، وتسمى المحقنة رقم ثلاثة. اسحب حوالي 70 µL من محلول الترسيب داخلها.

افصل الإبرة من المحقنة رقم ثلاثة مع الإبقاء على الكرة الصغيرة من التفلون داخل المحقنة. صِل المحقنتين رقم اثنين ورقم ثلاثة بواسطة الوصلة، مع التأكد من وضع الكرات الصغيرة من التفلون بشكل صحيح في كلتا المحقنتين. اربط الوصلة بإحكام في موضعها بعناية.

وجه المحاقن المقترنة رأسيًا، بحيث تكون المحقنة رقم اثنين في الأسفل، ثم احقن عينة LCP المحملة بالبروتين من المحقنة رقم اثنين إلى المحقنة رقم ثلاثة ببطء وثبات، حتى يلامس خيط LCP مكبس المحقنة رقم ثلاثة. سيبلغ حجم LCP المحقون حوالي 1/10 من حجم المادة المرسبة الأولية في المحقنة رقم ثلاثة. تحقق من الحجم من خلال قراءة المقياس في كلتا المحقنتين.

بعد ذلك، قم بفصل المحقنة رقم اثنين. يكون الموصل الآن متصلاً فقط بالمحقنة رقم ثلاثة، والتي تحتوي على العينة المغمورة في محلول المرسب. استخدم Parafilm لإغلاق المحقنة رقم ثلاثة تماماً، بما في ذلك الواجهة بين المكبس والمحقنة، والطرف المفتوح للموصل، وصامولة الإبرة.

قد يؤدي الإغلاق غير المكتمل خلال هذه الخطوة إلى تغيير ظروف الترسيب وجفاف العينة. كرر خطوات حقن عينة LCP المحملة بالبروتين لإعداد البلورة في ست محاقن إضافية، باستخدام ما مجموعه 50 µL تقريبًا من عينة LCP. تُحفظ المحاقن المغلقة في كيس بلاستيكي قابل للإغلاق مع منديلين أو منديل واحد من مناديل التنظيف الخالية من الألياف مبللة مسبقًا بالماء للحماية من جفاف العينة.

أغلق الكيس بإحكام، واحفظ المحاقن في حاضنة عند درجة حرارة 20-degree-Celsius أثناء نمو البلورات. وللكشف عن البلورات، أخرج المحاقن من الحاضنة لفحص عينات LCP مباشرة داخل المحاقن كل 12 إلى 24 ساعة باستخدام مجهر ستيريو مزود بضوء مستقطب متعامد. تُحدد البلورات على أنها جزيئات لامعة متراصة، أو، في حالة صغر حجم البلورات، على شكل توهج منتظم ينبعث من خيط LCP.

أعد المحاقن المختومة إلى الكيس، وخزنها عند 20 درجة Celsius لاستخدامها مستقبلاً. تعد خطوة معايرة الدهون ضرورية لامتصاص محلول المرسب الزائد ولمنع تجمد الدهون عند الحقن في حزمة ليزر الإلكترونات الحرة للأشعة السينية. وقبل حوالي ساعة واحدة من بدء جمع البيانات، أخرج المحاقن التي تحتوي على العينات من الحاضنة الموجودة عند 20 درجة Celsius.

اختر محقنتين إلى أربع محقنات لدمج العينات بناءً على تشابه مظهر البلورات وتقارب ظروف التبلور. قم بإزالة غطاء سد Parafilm بعناية من المحقنات المختارة. أزل وصلة المحقنة، وقم بتثبيت إبرة نظيفة قابلة للإزالة بالمحقنة الأولى المختارة.

ادفع المكبس للأمام برفق وببطء لعصر المادة المرسبة عبر الإبرة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق. توخَّ الحذر في هذه الخطوة؛ لأن تطبيق ضغط عالٍ على المكبس قد يؤدي إلى قذف بعض مادة LCP المحملة بالبلورات مع محلول الترسيب، مما يؤدي إلى فقدان جزئي أو كلي للعينة. توقف عن دفع المكبس عندما يتم إزالة معظم المادة المرسبة وتتراكم مادة LCP عند مدخل الإبرة.

كرر هذه العملية مع المحاقن الأخرى المختارة. ولدمج عينات LCP الناتجة، صِل محقنتين معاً باستخدام وصلة نظيفة. اضغط على المكبس في إحدى المحقنتين لنقل العينة بأكملها من محقنة إلى أخرى.

افصل المحقنة الفارغة. كرر هذه الخطوة لتجميع كل مادة LCP المحملة بالبلورات في محقنة واحدة. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المادة المرسبة.

أضف حوالي 5 µL من 7.9 MAG أو ليبيد المضيف MAG الأصلي قصير السلسلة إلى محقنة فارغة. قم بتوصيل هذه المحقنة بالمحقنة التي تحتوي على العينة المدمجة باستخدام وصلة محاقن، واخلط المكونات عن طريق الضغط بالتناوب على مكابس المحاقن. كرر هذه العملية حتى يتم امتصاص جميع المحاليل المتبقية ويتكون LCP متجانس وشفاف.

انقل عينة LCP المختلطة بالكامل إلى محقنة واحدة، وافصل المحقنة الفارغة. قم بتركيب إبرة تحميل حاقن LCP في المحقنة التي تحتوي على العينة المجمعة. أفرغ بعناية حوالي 1 µL من عينة LCP على شريحة زجاجية، ثم غطّها بغطاء شريحة زجاجي.

اضغط برفق على غطاء الشريحة لتثبيت العينة بين شريحتي الزجاج. التقط صوراً لعينة LCP تحت مجهر ستيريو بأعلى تكبير ممكن، باستخدام إضاءة الحقل المضيء ومستقطبات متقاطعة. وإذا أمكن، التقط صوراً إضافية باستخدام مجهر وجهاز تصوير بالفلورة فوق البنفسجية (UV) لتأكيد وجود بلورات بروتينية دقيقة في العينة.

قم بتقدير حجم البلورة وكثافتها. ستعتمد كثافة البلورات المثالية لتجربة جمع البيانات على حجم البلورة، وقطر شعاع الأشعة السينية، وقطر تدفق LCP، ويجب أن تؤدي إلى معدل إصابة للبلورات يتراوح بين 10 إلى 40% تقريباً. وأخيراً، قم بتعبئة حاقن LCP، وأجرِ عملية علم البلورات التسلسلي بالفيمتو ثانية باستخدام LCP، أو جمع بيانات LCP SFX، كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. تظهر هنا بلورات دقيقة لمستقبل السيروتونين في معقد مع الإرغوتامين مصورة باستخدام وضع المجهر ذو المجال المضيء، ومصورة باستخدام وضع المجهر الضوئي مستقطب الضوء المتقاطع.

تم الحصول على بنية معقد مستقبل السيروتونين مع الإرغوتامين باستخدام نهج LCP SFX. تظهر هنا بلورات دقيقة لمستقبل السموثانت في معقد مع السيكلوبامين، والتي تم تصويرها باستخدام وضع المجهر المستقطب متقاطعاً. تم الحصول على بنية معقد المستقبل مع السيكلوبامين باستخدام نهج LCP SFX.

بمجرد إتقان هذا الإجراء، يمكن إنجازه في أقل من ساعتين إذا تم تنفيذه بشكل صحيح. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية حول بنية بروتينات الغشاء المستهدفة، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على البروتينات الأخرى مع إجراء تعديلات طفيفة. وتمتد تطبيقات هذه التقنية إلى اكتشاف الأدوية؛ لأن البنى عالية الدقة توفر نماذج ممتازة لتفاعلات البروتينات مع الليجاندات القياسية، وتساعد في تصميم أدوية أكثر فعالية.