Name: حشوية حقن مكروي في الثروة الحيوانية بيضات ملقحة بمساعدة الليزر (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: اكتشف تقنية الحقن المجهري في السيتوبلازم لأجنة الثروة الحيوانية باستخدام إبرة ذات طرف غير حاد بمساعدة الليزر. تُمكّن هذه الطريقة من توصيل أدوات تحرير الجينوم مثل CRISPR Cas9 لإنتاج حيوانات معدلة وراثياً بكفاءة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يتم دعم العمل المتعلق بهذه التقنية من قبل مشاريع NIH / NICHD RO1 HD070044 ومشاريع USDA / NIFA Hatch W-3171 و W-2112.

1. Micropipette الإنتاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن micropipette <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع الشعرية البورسليكات الزجاج (القطر الخارجي (OD): 1.0 ملم، القطر الداخلي (ID): 0.75 ملم) في مجتذب micropipette (في وسط اليمين والشعرية الجهة اليسرى للحامل اللقب) وقفله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البرنامج المناسب لسحب الزجاج الشعرية لذلك يؤدي في تلميح رقيقة مع جامع طويلة. (مثال: الحرارة: 825؛ سحب: 30؛ السرعة: 120، المدة: 200؛ الضغط: 500). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية ماصات سحبت من الجهاز ووضعه على microforge في وضع أفقي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب ماصة سحبت وmicroforge سخان خيوط مع حبة الزجاج لها إلى التركيز. استخدام الشبيكة العدسة لقياس سمك المطلوب ونقل ماصة أفقيا حتى يصل إلى خيوط سخان القطر الداخلي الهدف (5 ميكرون). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الحرارة إلى حوالي 45٪، وجلب بلطف ماصة أسفل حتى يلامس خيوط. تفعيل سخان لفترة وجيزة. هذا ثتذوب سوء قليلا ماصة لذلك تتمسك خيوط وعلى التبريد، وماصة كسر في نقطة الاتصال توليد قطع على التوالي. ملاحظة: ضبط درجة الحرارة المناسبة هو مفتاح الحل في هذه الخطوة منذ درجات حرارة عالية جدا سيجعل منحنى ماصة، وبالتالي فإن قطع على التوالي لن يكون ممكنا، وسوف درجات حرارة منخفضة جدا لا تكون كافية لإذابة ماصة (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقديم التقريبية 30 درجة زاوية بالقرب من غيض ماصة بوضعها حوالي 10 ميكرون بعيدا عن خيوط سخان. ضبط درجة الحرارة إلى 60٪ وتفعيل سخان. ملاحظة: هذا ثني ماصة على خيوط. هذا هو المطلوب زاوية حتى غيض من الإبرة موازية للسطح لوحة حقن عندما شنت في محقن (الشكل 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعامل مع ماصات حقن مكروي بحذر لأنها حادة جدا وهشة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> micropipette عقد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع borosilicأكل الزجاج الشعرية (OD: 1.0 مم، الرقم: 0.75 مم) في مجتذب micropipette (في وسط اليمين والشعرية الجهة اليسرى للحامل اللقب) وقفله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام البرنامج المناسب لسحب الزجاج الشعرية لذلك يؤدي في تلميح رقيقة مع طويلة حتى تفتق والجدران الموازية (مثال: الحرارة: 815؛ سحب: 20؛ السرعة: 140، المدة: 175؛ الضغط: 200). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية ماصة سحبها من جهاز مجتذب ووضعه على حامل microforge في وضع أفقي. ضبط التركيز على خيوط سخان وماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الشبيكة العدسة لقياس قطرها ماصة ونقل ماصة حتى قطرها على خيوط يصل 180 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفيما يتعلق بحجم المشار إليه، بمناسبة الزجاج الشعرية مع طرف قلم الماس، ثم اضغط بلطف على طرف سحبت لكسر الزجاج. وهذا ينبغي أن يؤدي إلى قطع على التوالي (الشكل 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل ماصة لوضع عمودي مع طرفها قريب من خيوط. ضبط درجة الحرارة<html> من microforge إلى 60٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النار تلميع غيض من ماصة باستخدام التقنيات القياسية 7 حتى يصل معرف من 40 ميكرون. استخدام الشبيكة العدسة للتحقق من الهوية (1D الشكل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل زاوية على ماصة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جلب ماصة مرة أخرى إلى الوضع الأفقي حوالي 10 ميكرون بعيدا عن خيوط و 5 ملم بعيدا من طرفها. ضبط درجة الحرارة إلى ما يقرب من 60٪ وتفعيل سخان لثني ماصة على خيوط. يستمر التسخين حتى يتم التوصل إلى زاوية المطلوب (حوالي 30 س). تحقق من زاوية بصريا (الشكل 1E). ملاحظة: شنت ماصة عادة إلى microinjector في زاوية تقارب 60 درجة بالنسبة إلى الجزء السفلي من الطبق الحقن. عازمة غيض من ماصة لذلك هو مواز لقاع الطبق، وهو أمر ضروري لحقن الصحيح للجنين في الطائرة المتوسطة لها. </li></ol></li></ol></li></ol>لو &quot;&gt; 2. الإعداد Micromanipulator <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن microinjectors يتم تحميلها بشكل كامل مع النفط وعدم وجود فقاعات الهواء في النظام (فقاعات في microinjector منع مراقبة دقيقة من الحقن). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن micromanipulators هم في موقف وسط. وهذا سوف يسمح لمجموعة واسعة من حركة ماصات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج ماصة عقد في حامل micromanipulator الأيسر وماصة الحقن في حامل المجهرية الصحيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح النفط للدخول في ماصات من الشعرية والتحقق من أن النظام يعمل بشكل صحيح عن طريق نقل النفط صعودا وهبوطا داخل ماصة باستخدام عناصر التحكم microinjector. ملاحظة: إذا كان هناك أي تحرك النفط داخل الإبر، قد يكون هناك تسد. في هذه الحالة، استخدم إبرة جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدم عناصر التحكم micromanipulator لجلب ماصات في وسط الميدان المجهر وجهة نظر. باستخدام 4X التكبير، تأكد من أن نصائح micropipette هي في الزاوية الصحيحة (صarallel إلى أسفل الطبق). ملاحظة: الإعداد الصحيح من الإبر هو المفتاح لنجاح الحقن والنتائج الاتساق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة نظام ليزر التالية دليل معايرة الشركة المصنعة. </li></ol> 3. إعداد حقن طبق (الشكل 2) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة 50 ميكرولتر من درجة حرارة (37 درجة مئوية) SOF-HEPES (تكوين مفصلة في قسم المواد) تستكمل مع 20٪ مصل بقري جنيني (FBS) في وسط غطاء من 100 ملم طبق بتري. ضع 1 - قطرة ميكرولتر 2 من الحل ليتم حقنه على مقربة من انخفاض الحقن. تأكد من أن الأجنة لا يبرد أدناه RT. ملاحظة: في هذا البروتوكول سوف نقوم بإضافة صبغ ديكستران الأحمر إلى حل عن طريق الحقن لتكون قادرة على تصور موقع الحقن وتتبع في وقت لاحق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية قطرات في لوحة الحقن باستخدام حوالي 10 مل من الزيوت المعدنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع طبق حقن على مسرح المجهر المقلوب وجلب نقطةettes إلى انخفاض الحقن. تأكد من أن الإبر في التركيز داخل قطرة. ضبط ارتفاعها حسب الحاجة باستخدام عناصر التحكم micromanipulator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام microdispenser، تحميل حوالي 20 - 30 بيضات ملقحة (17-20 ساعة بعد الإخصاب (HPF)) في الجانب العلوي من انخفاض الحقن. أداء حقن في درجة حرارة الغرفة حتى يتم تحديد عدد الأجنة في انخفاض حقن من السرعة التي يمكن للشخص أن ضخها. لا تحميل المزيد من الأجنة من تلك التي يمكن حقنها في 30 دقيقة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحميل الأجنة في microdispenser، تضغط على المكبس بشكل كامل وتزج طرف في محلول يحتوي على الأجنة. لمس الأجنة ويمكن الحصول عليها مع غيض من الزجاج الشعرية (واحد في ذلك الوقت) والافراج عن ببطء الغطاس حتى يدخل كل جنين في شعري. كرر هذا حتى يتم القبض على جميع الأجنة أعلى أو القدرة microdispenser ممتلئ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للافراج عن الأجنة تحميل، كساد الغطاس بلطف حتى كامل حجم التعاونntaining الأجنة يتم تحريرها من الشعيرات الدموية. </li></ol></li></ol> 4. حقن مكروي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الهدف 4X، تحميل الحل ليتم حقنه في ماصة حقن عن طريق الضغط السلبي (الشفط). تحميل حلا كافيا لحقن 2-3 بيضات ملقحة. ثم نقل إلى تراجع الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> داخل قطرة حقن، نقل ماصة عقد حتى يحصل على معلومات سرية بالقرب من البيضة الملقحة. الضغط السلبي (نضح) مع microinjector عقد حتى يحصل ثابتة البيضة الملقحة إلى ماصة عقد والتغيير إلى الهدف 20X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم إرفاق البيضة الملقحة إلى ماصة القابضة، والتحقق من جودة وذلك باستخدام ماصة حقن للتحرك بلطف الجنين في جميع أنحاء دون فصلها. وينبغي أن يكون البيضة الملقحة ذات نوعية جيدة الهيئات القطبية اثنين (على الرغم من أن في بعض الأحيان واحد فقط وينظر) والسيتوبلازم متجانسة. لا حقن بيضات ملقحة غير طبيعية (الشكل 3A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا لزم الأمر، إعادة الجنين لحقن السليمموقع. ومن شأن تحديد المواقع الجيدة تكون تلك التي هناك بعض المساحة بين ZP ومساء، حتى رئيس الوزراء لا تحصل على تضررت بواسطة الليزر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن ماصة حقن يتوضع على منتصف الطائرة-الجنين عن طريق لمس بلطف البيضة الملقحة في موقع الحقن. إذا لم يكن عن دورتها منتصف الطائرة، فإن إبرة تميل إلى جعل الجنين تدوير بدلا من ثقب. ضبط ارتفاع ماصة الحقن حسب الحاجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل ثقب في ZP باستخدام الليزر (الشكل 3B). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الليزر مكان البرمجيات الشبيكة الليزر في ZP حيث سيتم إجراء ثقب (على الجانب الآخر إلى حيث تعلق الجنين إلى ماصة القابضة). باستخدام جهاز التحكم الليزر نافذة انقر على زر اطلاق النار. تأكد من أن حجم الفتحة كبيرة بما يكفي لخلق فتحة في ZP للإبرة لتمرير من خلال دون الإضرار PM (مثال: 0،662 مللي ثانية نبض العرض / 6.9 ميكرون حجم ثقب). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمرير إبرة حقنمن خلال ثقب في ZP واجراء اتصالات مع رئيس الوزراء. مواصلة دفع ماصة إلى الأمام حتى الإبرة ¾ من الطريق في الجنين (الشكل 3C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة الموقف من الغضروف المفصلي في الطور البيني حل للنفط، حيث سيؤدي ذلك إلى أن تستخدم للسيطرة على الدوام حجم الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الضغط السلبي (نضح) على ماصة حقن، الأمر الذي سيؤدي في الظهر، والسيتوبلازم الذي يستنشق في إبرة الحقن. تستمر حتى حركة السيتوبلازم في إبرة يسرع أو عند المحتوى السيتوبلازم الخلط مع حقن محلول يمكن رؤيتها. وتشير هذه الكسر من رئيس الوزراء (الشكل 3D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حقن الظهر محتوى حشوية تليها الحل في سيتوبلازم البيضة الملقحة عن طريق تطبيق الضغط الايجابي (حقن)، حتى الغضروف المفصلي في الطور البيني حل للنفط تقدمت يعادل قطر البيضة الملقحة واحد بعد نقطة الانطلاق. ملاحظة: في ظل ظروف لدينا، وهذا ممثلى أعضاءsents حوالي 7 رر من حل حقن (الشكل 3E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التغيير إلى الهدف 4X ونقل حقن الجنين / ثانية إلى الجانب السفلي من انخفاض الحقن. الافراج عن الجنين عن طريق الضغط الإيجابي على microinjector القابضة. الحفاظ على الأجنة غير المحقونة على الجانب العلوي، وحقن تلك الموجودة على الجانب السفلي من الهبوط للمساعدة في تتبع حقن الأجنة / غير حقنه والعمل بكفاءة. </li></ol> 5. الأجنة استعادة وحقن نتائج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقديم 3 قطرات من حوالي 200 ميكرولتر في طبق جديد مع تسخينه مسبقا SOF-HEPES. جمع الأجنة حقن باستخدام microdispenser (كما هو موضح أعلاه). غسل الأجنة المحقونة عن طريق نقلها من خلال 3 SOF-HEPES يسقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدد الأجنة هي lysed خلال حقن مكروي والتخلص منها. ملاحظة: البيضة الملقحة هي lysed يمكن تمييزها بسهولة من واحدة سليمة منذ أول واحد يبدو شفافة، وملء ZP كله، وأنها عادة ما تكون حشويةمحتوى تسرب إلى خارج الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياريا، والتحقق من كفاءة حقن مكروي باستخدام المجهر الفلورسنت. كن على علم أن التعرض للأشعة فوق البنفسجية يمكن أن تحدث الضرر الجنين الذي يمكن أن يؤثر على تطور لاحق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جماعات ثقافة 25 الأجنة المحقونة في 50 قطرات ميكرولتر من المتوسطة البوتاسيوم البسيط الأمثل (KSOM) تستكمل مع 4 ملغ / مل ألبومين المصل البقري (BSA) تحت الزيوت المعدنية في 38.5 درجة مئوية، 5٪ CO 2 في الهواء، والرطوبة من التشبع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكملة سائل الإعلام والثقافة مع 5٪ FBS بعد يومين من الحقن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق الكيسة الأريمية (BL) معدلات 7 أيام بعد الحقن. حساب BL أسعار الفائدة في عدد من الأجنة الكيسة / العدد الكلي للأجنة مثقف في هذا الانخفاض. </li></ol>

<ol><li>McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+composition+of+lipids+in+immature+cattle%2C+pig+and+sheep+oocytes+with+intact+zona+pellucida%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida.</a> J Reprod Fertil. 118 (1), 163-170 (2000).</li>
<li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).</li>
<li>Ross, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parthenogenetic+activation+of+bovine+oocytes+using+bovine+and+murine+phospholipase+C+zeta%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta.</a> BMC Dev Biol. 8 (1), (2008).</li>
<li>Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jumonji+domain-containing+protein+3+regulates+histone+3+lysine+27+methylation+during+bovine+preimplantation+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2400-2405 (2012).</li>
<li>Bogliotti, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4+Developmental+outcomes+and+effiency+of+two+CRISPR%2FCas9+microinjection+methods+in+bovine+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Fertil+Dev%22%5BJournal%5D)">4 Developmental outcomes and effiency of two CRISPR/Cas9 microinjection methods in bovine zygotes.</a> Reprod Fertil Dev. 27 (1), 94-94 (2015).</li>
<li>Bakhtari, A., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DPPA3+prevents+cytosine+hydroxymethylation+of+the+maternal+pronucleus+and+is+required+for+normal+development+in+bovine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos.</a> Epigenetics. 9 (9), 1271-1279 (2014).</li>
<li>Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+process+of+polishing+borosilicate+glass+capillaries+used+for+fabrication+of+in-vitro+fertilization+%28iVF%29+micro-pipettes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes.</a> Biomed Microdevices. 10 (1), 123-128 (2008).</li>
<li>Sutter Instrument. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Pipette+Cookbook+2015+P-97+%26+P-1000+Micropipette+Pullers%22">Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers</a>. , Sutter Instrument. 
 <a target="_blank" href="www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf">www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf</a> (2015).</li>
<li>Sutter Instrument. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22P-97+Flaming%2FBrownTM+Micropipette+Puller+Operation+Manual+Rev.+2.30+-+DOM+%2820140825%29%22">P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 - DOM (20140825)</a>. , 
 <a target="_blank" href="www.sutter.com/manuals/P-97-DOM_OpMan.pdf">www.sutter.com/manuals/P-97-DOM_OpMan.pdf</a> (2014).</li>
<li>Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCibelli%2C+JB+%22Principles+of+cloning%22">Principles of cloning</a>. , Academic Press. (2002).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+reporter+gene+after+microinjection+of+mammalian+artificial+chromosomes+into+pronuclei+of+bovine+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes.</a> Mol Reprod Dev. 60 (4), 433-438 (2001).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Microinjection من بيضات ملقحة هي طريقة راسخة لتقديم حلول في أجنة الثدييات. مع بعض الاختلافات التي تعتمد على الأنواع والهدف من التجربة، وهذه التقنية يمكن استخدامها على نطاق واسع. وتبين لنا كيفية أداء حقن مكروي داخل الهيولى استخدام الليزر لمساعدة مدخل micropipette كليلة نهاية. بيضات ملقحة من بعض الأنواع الحيوانية (مثل الأبقار والأغنام والخنازير) لديها السيتوبلازم الظلام، مما يعوق تصور ماصة حقن مرة واحدة داخل الجنين. أيضا، أغشية البلازما الخاصة بهم ومرنة للغاية، مما يجعل اختراقهم بإب...

حقن مكروي حشوية الأجنة 1-الخلية هي تقنية قوية جدا. ويمكن استخدامه لتوصيل أي حل في جنين، على سبيل المثال، تنتج الجينات تدق الرافضة لدراسة وظيفة الجين أو لتوليد الحيوانات في تحرير الجين. بيضات ملقحة حيوانات المزرعة معظم ذات الصلة زراعيا لديها تكوين الأحماض الدهنية عالية جدا يجعل السيتوبلازم بها مبهمة والظلام 1. لديهم أيضا غشاء البلازما مرنة إلى حد ما (بعد الظهر). هذه الخصائص تجعل حقن مكروي باستخدام pronuclear التقليدي / حقن حشوية كما تستخدم في أنواع القوارض الصعبة وغالبا غير دقيقة. حقن مكروي حشوية مزاياه على حقن مكروي pronuclear لأنه من الأسهل لأداء ويسبب أيضا أقل الأضرار التي لحقت الأجنة المحقونة، مما أدى إلى ارتفاع قابلية 2. ويتمثل الهدف العام من هذا البروتوكول هو إظهار وسيلة ناجحة لتقديم حلول في سيتوبلازم بيضات ملقحة لحيوانات المزرعة. لتكون قادرة على أداءحقن مكروي حشوية مع كفاءة عالية على أجنة الماشية، يتم استخدام الليزر لتوليد حفرة في المنطقة الشفافة (ZP) وبعد ذلك يتم استخدام الزجاج إبرة حادة في نهاية لحقن مكروي. وتهدف هذه الاستراتيجية للحد من الأضرار الميكانيكية مطبوع على الجنين أثناء الحقن. ثم، تطلع محتوى حشوية داخل إبرة حقن يسمح الكسر كفاءة وثقة من رئيس الوزراء ضمان أن الحل يتم تسليم إلى السيتوبلازم للجنين. وقد تم بالفعل استخدام هذه التقنية بنجاح في أجنة الأبقار لتسليم سيرنا إلى السيتوبلازم اقحي 3،4 وتوليد الطفرات باستخدام تتجمع interspaced بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) / كريسبر يرتبط نظام 9 (Cas9) نظام 5. بل هو أيضا مناسبة (مع تعديلات طفيفة) لحقن الأبقار المغلقة الركامية البويضات 6. هنا، وصفنا لدينا بروتوكول حقن تقديم صبغة، التي يمكن أن تكون قابلة للتطبيق لحقن أي ديحل IRED في البيضة الملقحة، وتبين أن استخدام هذا الأسلوب يسبب الحد الأدنى من تحلل و لا يؤثر على تطور الجنين في وقت مبكر.

<table><tbody><tr><td>مجتذب الماصات الدقيقة</td><td>أداة Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>أدوات Sutter الشعرية الزجاجية</td><td></td><td>B100-75-10</td> تستخدم <td>هذه الشعيرات الدموية لصنع الماصات المثبتة وحقنها. يمكن استخدام أي أنابيب بورسليكات سميكة / قياسية بدون خيوط.</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-9</td><td>مجهزة بعدسة تكبير 10X.</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Nikon / Narishige</td><td>NT88-V3</td><td></td></tr><tr><td>مجهر مقلوب</td><td>نيكون</td><td>TE2000-U</td><td>مزود بعدسات 4X و 20X ونظام ليزر.</td></tr><tr><td>أدوات أبحاث</td> <td>الليزر</td><td>7-47-500</td><td>زحل 5 ليزر نشط.</td></tr><tr><td>موزع دقيق</td><td>دروموند</td><td>3-000-105</td><td>يستخدم الموزع الدقيق لتحريك الأجنة. يمكن أيضا استخدام ماصة p10 مع تحميل أقل حجم ممكن.</td></tr><tr><td>طبق ثقافة 100 × 15 مم</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>استخدم غطاء الطبق لعمل لوحة الحقن نظرا لجدرانها السفلية وستجعل وضع وتحريك المعالج الدقيق أسهل. يمكن أيضا استخدام غطاء طبق ثقافة 60 مم.</td></tr><tr><td>طبق ثقافة 35 مم</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>تستخدم هذه الأطباق لزراعة الأجنة في 50 مو ؛ ل قطرات مغطاة بالزيت المعدني. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا استخدام طبق 4 آبار. بغض النظر عن الطبق المختار لزراعة الأجنة ، يجب دائما موازنتها في الحاضنة لمدة 4 ساعات على الأقل قبل نقل الأجنة إليها.</td></tr><tr><td>حاضنة</td><td>سانيو</td><td>MCO-19AIC</td><td>أي حاضنة يمكن ضبطها على 38.5 درجة ؛ C ، يمكن استخدام ظروف C 2 .</td></tr><tr><td>مجهر مجسم</td><td>نيكون</td><td>SMZ800</td><td>يستخدم لتصور الأجنة في قطرات الثقافة وأثناء الغسيل. يمكن استخدام أي مجهر مجسم بتكبير 10X.</td></tr><tr><td>وحدة التحكم HT</td><td>Minitube</td><td>12055/0400</td><td>نظام تسخين متصل بالمجهر المجسم.</td></tr>مرحلة <tr><td>المجهر الساخن</td><td>Minitube</td><td>12055/0003</td><td>نظام التدفئة المتصل بالمجهر المجسم.</td></tr><tr><td>ديكستران ريد</td><td>ثيرمو ساینتفيك</td><td>D1828</td><td>يستخدم محلول معقم 10 مجم / مل للحقن.</td></tr><tr><td>الزيوت المعدنية</td><td>sigma</td><td>M8410</td><td>حافظ على الزيت المعدني في درجة حرارة الغرفة و &nbsp; محمي من الضوء باستخدام ورق القصدير.</td></tr><tr><td>KSOMaa Evolve Bovine</td><td>Zenit</td><td>ZEBV-100</td><td>مكمل ب 4 مجم / مل BSA. يجب موازنة ألواح KSOM لزراعة الأجنة في حاضنة لمدة 4 ساعات على الأقل قبل الاستخدام.</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-525</td><td>استخدم FBS مؤهلا للخلايا الجذعية.</td></tr>يتم حقن <tr><td>البيضة الملقحة</td><td></td><td></td><td>من 17 إلى 20 hpf ويمكن اشتقاقها in-vitro- أو in-vivo-.</td></tr><tr><td>كلوريد الصوديوم</td><td>سيجما</td><td>S5886</td><td>التركيز النهائي: 107.7 مليمتر. مكون من وسط SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>التركيز النهائي: 7.16 ملليمتر. مكون من وسط SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>التركيز النهائي: 1.19 مليمتر. مكون من وسط SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td>التركيز النهائي: 0.49 مليمتر. مكون من وسط SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>الصوديوم DL-lactate</td><td>Sigma</td><td>L4263</td><td>التركيز النهائي: 5.3 مليمتر. مكون من وسط SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>CaCl2-2H2O&nbsp;</td><td>سيجما</td><td>C7902</td><td>التركيز النهائي: 1.71 ملليمتر. مكون من وسط SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>D- (& ناقص;)-الفركتوز&nbsp;</td><td>سيجما</td><td>F3510</td><td>التركيز النهائي: 0.5 ملليمتر. مكون من وسط SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>سيجما</td><td>H4034</td><td>التركيز النهائي: 21 ملم. مكون من وسط SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>التركيز النهائي: 1x. مكون من وسط SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>BME-EAA</td><td>Sigma</td><td>B6766</td><td>التركيز النهائي: 1x. مكون من وسط SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>التركيز النهائي: 4 مليمتر. مكون من وسط SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>بيروفات الصوديوم</td><td>سيجما</td><td>P4562</td><td>التركيز النهائي: 0.33 مليمتر. مكون من وسط SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>جلوتاماكس</td><td>جيبكو</td><td>35050</td><td>التركيز النهائي: 1 ملليمتر. مكون من وسط SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-3311</td><td>التركيز النهائي: 1 مجم / مل. مكون من وسط SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>جنتاميسين</td><td>سيجما</td><td>G-1397</td><td>التركيز النهائي: 5 مو ؛ جم / مل. مكون من وسط SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>الماء لنقل الأجنة</td><td>Sigma</td><td>W1503</td><td>مكون من وسط SOF-HEPES.</td></tr><tr><td>SOF-HEPES متوسط</td><td>صنع في المختبر</td><td></td><td>درجة الحموضة 7.3 - 7.4 ، 280 & plusmn ؛ 10 مللي أوس. تصفية معقمة من خلال 22 & mu; يمكن تخزين مرشح M في الثلاجة عند 4 درجات ؛ ج لمدة 1 شهر. دافئ في 37 درجة. ج حمام مائي قبل الاستخدام.</td></tr></tbody></table>

حشوية حقن مكروي في الثروة الحيوانية بيضات ملقحة بمساعدة الليزر

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

يعد الحقن المجهري السيتوبلازمي في أجنة أحادية الخلية تقنية قوية للغاية. على سبيل المثال ، يتيح توصيل أدوات تحرير الجينوم التي يمكن أن تخلق تعديلات جينية ستكون موجودة في كل خلية من كائن حي بالغ. يمكن استخدامه أيضا لتوصيل siRNA أو mRNAs أو الأجسام المضادة الحجب لدراسة وظيفة الجينات في أجنة ما قبل الزرع. تتكون التقنية التقليدية للحقن الدقيق للأجنة المستخدمة في القوارض من ماصة دقيقة رفيعة جدا تخترق غشاء البلازما مباشرة عند تقدمها إلى الجنين. عندما يتم تطبيق هذه التقنية على الماشية ، فإنها عادة ما تؤدي إلى انخفاض الكفاءة. هذا يرجع أساسا إلى أنه على عكس الفئران والجرذان ، فإن البيضات البيقارية والأغنام والخنازير لديها سيتوبلازم غامق جدا وغشاء بلازما عالي المرونة يجعل من الصعب تحقيق التصور أثناء الحقن واختراق غشاء البلازما. في هذا البروتوكول ، نصف طريقة حقن مجهرية مناسبة لتوصيل المحاليل إلى سيتوبلازم زيجوت الماشية والتي أثبتت نجاحها لأجنة الأغنام والخنازير أيضا. أولا ، يتم استخدام الليزر لإحداث ثقب في المنطقة الشفافة. ثم يتم إدخال ماصة زجاجية غير حادة من خلال الفتحة وتتقدم حتى يصل طرف الإبرة إلى حوالي 3/4 في الجنين. بعد ذلك ، يتم كسر غشاء البلازما عن طريق شفط المحتوى السيتوبلازمي داخل الإبرة. أخيرا ، يتم حقن المحتوى السيتوبلازمي المستنشق متبوعا بالمحلول المعني مرة أخرى في السيتوبلازم الجنيني. تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح لتوصيل محاليل مختلفة إلى البيضة الملقحة البقرية والأغنام بكفاءة 100٪ ، والحد الأدنى من التحلل ، ومعدلات نمو الأكياس الأريمية الطبيعية.

بمساعدة الليزر حقن مكروي حشوية هو بروتوكول قوية وموثوق بها لتقديم حلول في سيتوبلازم بيضات ملقحة الماشية. ويبين الشكل 3 مخطط العام للبيضات ملقحة قبل وبعد حقن فضلا عن مخطط الشامل لهذه التقنية. يستخدم ديكستران الحمراء عن طريق الحقن الحل للسماح الموقع تتبع الحقن والحقن كفاءة ودقة. ويتضح نجاح تنفيذ الحل في الشكل 4 يظهر الجنين حقن مؤخرا والتي يتم توزيعها الصبغة متجانس في السيتوبلازم. باستخدام هذه التقنية يتم حقن 100٪ من ...

يوضح هذا البروتوكول كيفية إجراء الحقن المجهري السيتوبلازمي في البيضة البيقية لحيوانات المزرعة. يمكن استخدام هذه التقنية لتوصيل أي حل إلى الجنين أحادي الخلية مثل أدوات تحرير الجينوم لتوليد بالضربة القاضية.

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو توصيل المحاليل بفعالية إلى سيتوبلازم زيجوتات الماشية باستخدام إبرة ذات نهاية غير مدببة بمساعدة الليزر. تُستخدم هذه الطريقة في الأبحاث وفي مجال النقل الجيني للحيوانات، وبما أنها ترتبط بأداة لتحرير الجينوم، مثل نظام CRISPR Cas9، فإنها تتيح إنتاج أبقار جديدة لدراسة وظائف الجينات والحيوانات المعدلة وراثياً بطريقة بسيطة وموثوقة للغاية. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية استخدامها لتوصيل أي محلول إلى سيتوبلازم زيجوتات الحيوانات الكبيرة.تؤدي كفاءة الحقن المتقنة إلى تقليل معدلات التلف في كبد الحيوان. أولاً، قم بتجهيز الماصة الدقيقة للحقن عن طريق وضع شعيرة زجاجية من البوروسيليكات في جهاز سحب الماصات الدقيقة وتثبيتها في مكانها. استخدم برنامجاً مناسباً لسحب الشعيرة بحيث تنتج طرفاً رفيعاً ذا تدرج طويل.بعد ذلك، قم بإزالة الماصات المسحوبة بعناية من الجهاز وضعها على جهاز صهر دقيق (microforge) في وضع أفقي. اجعل الماصة المسحوبة وسلك تسخين جهاز الصهر الدقيق، مع الخرزة الزجاجية الموجودة به، في نطاق التركيز. استخدم مقياس العدسة الشيئية لقياس السمك المطلوب، وحرك الماصة أفقيًا حتى يصل سلك التسخين إلى القطر الداخلي المستهدف البالغ 5 µm.اضبط الحرارة إلى حوالي 45% وأنزل الماصة برفق حتى تلامس الفتيلة. ثم قم بتفعيل السخان لفترة وجيزة؛ سيؤدي ذلك إلى صهر الماصة قليلاً لتلتصق بالفتيلة، وعند التبريد، ستنكسر الماصة عند نقطة التلامس، مما ينتج عنه قطع مستقيم.يعد ضبط درجة الحرارة الصحيحة أمرًا أساسيًا في هذه الخطوة. فدرجات الحرارة المرتفعة جدًا ستؤدي إلى ثني الماصة، بينما لن تكون درجات الحرارة المنخفضة جدًا كافية لقطع الماصة. بعد ذلك، قم بتكوين زاوية تقريبية قدرها 30 درجة بالقرب من طرف الماصة عن طريق وضع الطرف على بعد 10 micrometers تقريبًا من فتيل السخان.اضبط درجة الحرارة على 60% وقم بتنشيط السخان بحيث تنثني الماصة فوق الفتيلة بالزاوية المطلوبة. وباستخدام الإعدادات الموضحة هنا، اسحب شعيرية زجاجية لإنتاج ماصة دقيقة ذات طرف رفيع وتناقص تدريجي طويل ومنتظم وجدران متوازية. أخرج الماصة المسحوبة بعناية من جهاز السحب وضعها في وضع أفقي على حامل الميكروفورج (microforge).استخدم مقياس العدسة العينية لقياس قطر الماصة، ثم حرك الماصة حتى يصل قطرها فوق الشعيرة إلى 180 micrometers. حدد الشعيرة الزجاجية باستخدام قلم ذو رأس ماسي، ثم اضغط بلطف على الطرف المسحوب لكسر الزجاج. يجب أن يؤدي ذلك إلى قطع مستقيم.بعد ذلك، انقل الماصة إلى وضع رأسي، بحيث تكون طرفها قريبة من الفتيل. اضبط درجة حرارة الميكروفورج (microforge) على 60% وقم بصقل طرف الماصة بالنار، باستخدام التقنيات القياسية حتى يصل القطر الداخلي إلى الحجم المستهدف. قم بقياس القطر الداخلي للماصة، والذي يجب أن يكون 40 micrometers.باستخدام نفس الإجراء السابق، قم بثني الطرف بزاوية 30 درجة. أدخل ماصة التثبيت في حامل المجهر الميكرومناور الأيسر وماصة الحقن في حامل المجهر الميكرومناور الأيمن. ثم، املأ ماصة الحقن بالزيت.استخدم أدوات التحكم في المجهر الدقيق (micro-manipulator) لإحضار الماصات إلى مركز مجال رؤية المجهر. باستخدام تكبير 4X، تحقق من أن رؤوس الماصات الدقيقة في الزاوية الصحيحة بحيث تكون موازية لقاع الطبق. ضع قطرة بحجم 50 µL من محلول SOF-HEPES بدرجة حرارة 37 °C، والمُدعم بنسبة 20% FBS، في مركز غطاء طبق بتري بقطر 100 millimeter.بعد ذلك، ضع قطرة بحجم 1 إلى 2 µL من المحلول المراد حقنه بالقرب من قطرة الحقن. ثم، قم بتغطية القطرات ولوحة الحقن باستخدام 10 mL تقريبًا من الزيت المعدني. ضع اللوحة على منصة المجهر واستخدم موزّعًا دقيقًا لتحميل حوالي 20 إلى 30 زيجوت في الجانب العلوي من قطرة الحقن.باستخدام العدسة الشيئية 4X، قم بتعبئة المحلول المراد حقنه في ماصة الحقن عن طريق تسليط ضغط سلبي على المحقن الدقيق. قم بتعبئة كمية كافية من المحلول لحقن زيجوتَين إلى ثلاثة زيجوتات، ثم انتقل إلى قطرة الحقن. داخل قطرة الحقن، حرك ماصة التثبيت بحيث يقترب طرفها من الزيجوت.قم بتطبيق ضغط سلبي باستخدام الماحق الدقيق للتثبيت حتى يتم تثبيت الزيجوت في ماصة التثبيت. بمجرد تأمين الزيجوت، انتقل إلى استخدام عدسة شيئية بقوة 20X. تحقق من وضع ماصة الحقن على المستوى المتوسط للجنين عن طريق لمس الزيجوت بلطف في موقع الحقن.إذا لم تكن الإبرة في المستوى المتوسط، فستميل إلى تدوير الجنين بدلاً من ثقبه. بعد ذلك، استخدم البرنامج لوضع الليزر بشكل رأسي في المنطقة الشفافة (zona pellucida) حيث سيتم صنع الثقب. وبمجرد تحديد الموضع بشكل صحيح، استخدم نافذة التحكم في الليزر وانقر فوق زر الإطلاق (FIRE).تأكد من أن حجم الثقب كبير بما يكفي لإحداث فتحة في المنطقة الشفافة (zona pellucida) تسمح بمرور الإبرة دون إتلاف الغشاء البلازمي. مرر إبرة الحقن عبر الثقب الموجود في المنطقة الشفافة حتى تلامس الغشاء البلازمي. استمر في دفع الماصة للأمام حتى تخترق الإبرة 3/4 مسافة الجنين.لاحظ موضع السطح الهلالي عند البينطاق الفاصل بين المحلول والزيت؛ حيث سيُستخدم ذلك للتحكم في حجم الحقن بشكل ثابت. طبق ضغطاً سالباً على ماصة الحقن لسحب الغشاء البلازمي والسيتوبلازم إلى إبرة الحقن.استمر في العملية حتى تتسارع حركة السيتوبلازم في الإبرة أو عندما يُلاحظ تدفق محتويات السيتوبلازم واختلاطها بمحلول الحقن؛ حيث يشير ذلك إلى تمزق الغشاء البلازمي. أعد حقن محتوى السيتوبلازم، يليه المحلول، إلى سيتوبلازم الزيجوت عن طريق تطبيق ضغط إيجابي حتى يتقدم السطح المقعر عند الواجهة الفاصلة بين المحلول والزيت بمقدار يعادل قطر زيجوت واحد بعد نقطة البداية.بعد ذلك، قم بالتغيير إلى عدسة شيئية بقوة 4X، وحرك الجنين المحقون إلى الجانب السفلي من قطرة الحقن. حرر الجنين عن طريق تطبيق ضغط إيجابي على الميكرو-حقنة المثبتة. اجمع الأجنة المحقونة باستخدام موزع دقيق.اغسل الأجنة المحقونة عن طريق نقلها عبر ثلاث قطرات من SOF-HEPES ثم قم بتنبيتها، كما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق. يمكن رؤية نجاح توصيل المحلول في الصورة الفلورية، حيث يتم استخدام dexion red لتتبع موقع الحقن وكفاءته ودقته. هنا، يتوزع الصبغ بشكل متجانس في السيتوبلازم، وهو أمر شائع عند استخدام هذه التقنية.يتميز هذا البروتوكول بمعدلات تحلل أدنى في الزيجوتات البقرية والضأنية. حيث تحلل عدد قليل من الأجنة المحقونة في الأبقار أو الأغنام نتيجة لعملية الحقن المجهري. كما لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية في معدلات تطور الكيسة الأرومية بين المجموعات الضابطة والمجموعات المحقونة لكل من الأجنة البقرية والضأنية.بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها بمعدل جنينين في الدقيقة. ومن خلال كفاءة الحقن لدى الشخص الماهر، يتم تقليل معدلات استهلاك الكيسات الأريمية الحيوانية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون على دراية بكيفية إجراء الحقن المجهري داخل السيتوبلازم بمساعدة الليزر في زيجوتات الماشية.وكذلك كيفية استخدام ضغط الشفط الموجب والسالب لضمان تمزق الغشاء البلازمي من أجل توصيل فعال.

laser-assisted-cytoplasmic-microinjection-in-livestock-zygotes

Research

JoVE Journal

Genetics

علم الوراثة

Microinjection طريقة راسخة وفعالة لإدخال المؤثرات الأجنبية في الأجنة المخصبة الزرد. هنا ، علينا أن نظهر تقنية microinjection قوية لأداء overexpression مرنا ، والدراسات morpholino ضربة قاضية قليل النوكليوتيد الجينات في الزرد.

Microinjection من مرنا والعقاقير [أليغنوكليوتيد] Morpholino اسماك الزرد في الأجنة.

هذا الفيديو يبين كيف يمكن حقنها أو morpholino مرنا في الأجنة الزرد في مرحلة واحدة الخلية إلى نقصان أو زيادة مستوى المنتجات جين معين خلال التطور اللاحق.

Microinjection الجنين اسماك الزرد إلى تحليل وظائف الجينات

يصف هذا الفيديو تقنية الحقن المجهري للأجنة لتوصيل المركبات إلى كيس صفار الزرد.

الحقن المجهري للأجنة: تقنية لتوصيل مركب إلى صفار الزرد

في هذا الفيديو ، نوضح الاختراق بمساعدة الليزر للطبقة الواقية من المنطقة الشفافة في البويضات المخصبة للفأر لتسهيل توصيل الجينات الفيروسية. يتيح فيروس العدسات توليد المعدلة وراثيا مع جين ذي أهمية مدمج بثبات في جينومها.

توصيل الجينات الفيروسية العدسية بمساعدة الليزر: تقنية لاختراق البويضات المخصبة للفأر لتسهيل توصيل الجينات الفيروسية العدسية

حقن مكروي هو أسلوب شائع يستخدم لتقديم بنيات الحمض النووي، mRNAs و، أليغنوكليوتيد] morpholino بواسطة العقاقير أو العلاجات الأخرى في البيض والأجنة، وخلايا الأنواع المختلفة.

عالية الإنتاجية إبر دقيقة جدا لقنفذ البحر بيضات ملقحة

الأساليب التي تنتج أجنة morphant ضرورية لدراسة آليات تنموية والشبكات التنظيمية الجينات. نجم البحر Patiria miniata هو نظام نموذجي الناشئة عن هذه الدراسات. هنا نقدم بروتوكول للحصول على الأمشاج، وتنتج ثقافات الأجنة، وحقن مكروي السريع للبيضات ملقحة من هذا النوع.

منهج في Microinjection من Patiria minata بيضات ملقحة

ذبابة فاكهة البحر الأبيض المتوسط (ذبابة متوسطة) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) هي آفة زراعية في جميع أنحاء العالم. يعد الفهم الأعمق لبيولوجيتها أمرا أساسيا للسيطرة على أعداد الذبابة المتوسطة وبالتالي تقليل التأثير الاقتصادي. يعد الحقن المجهري للأجنة أداة أساسية تسمح بتحويل الخط الجرثومي ودراسات علم الوراثة العكسي في هذا النوع.

تسليم الأحماض النووية من خلال حقن مكروي الأجنة في مكافحة الحشرات الحشرات الزراعية العالمية،<em&gt; آفة Ceratitis الرؤيسية</em

Microinjection اليرقات والأجنة الزرد أسلوب حاسم ولكنها صعبة المستخدمة في نماذج الزرد كثيرة. نقدم هنا، مجموعة من الأدوات عبارة للمساعدة في تحقيق الاستقرار والتوجه الزرد microinjection والتصوير.

أجهزة ميكروستروكتوريد Microinjection الأمثل وتصوير يرقات الزرد

ماوس البويضات المخصبة والأجنة مرحلة مبكرة محمية بواسطة zona pellucida، مصفوفة بروتين سكري يشكل عائقا يحول دون إيصال الجينات. توضح هذه المقالة بروتوكول لتثقيب زونا بليزر ترانسدوسي الخلايا الجنينية مع ناقلات لينتيفيرال وخلق الفئران المعدلة وراثيا.

بيض المخصب إيصال الجينات لينتيفيرال ساعد الليزر للماوس

يصف البروتوكول الحالي الحقن المجهري للزيجوت ل CRISPR-Cas9 والحمض النووي للمتبرع لإنتاج فئران كاسيت الجينات وفئرانها المتخبطة بكفاءة.

الحقن المجهري للزيجوت لإنشاء أليلات كاسيت الجينات وأليلات فلوكس في الفئران

اكتشف تقنية الحقن المجهري في السيتوبلازم لأجنة الثروة الحيوانية باستخدام إبرة ذات طرف غير حاد بمساعدة الليزر. تُمكّن هذه الطريقة من توصيل أدوات تحرير الجينوم مثل CRISPR Cas9 لإنتاج حيوانات معدلة وراثياً بكفاءة عالية.

حشوية حقن مكروي في الثروة الحيوانية بيضات ملقحة بمساعدة الليزر

استكشف المزيد من الفيديوهات