رواية عزل-ملزم RNA والبروتينات التي السريع المنهجية

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل RNA محدد بكفاءة مع البروتينات المرتبطة بهذا الـ RNA في الجسم الحي (in vivo). يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في استقلاب الـ RNA وتنظيمه، مثل تحديد المجموعة المتميزة من الـ fau-bee-pees المرتبطة بنسخة معينة. تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في الكفاءة العالية للعزل، مما يسمح بتحديد لاحق لبروتينات mRNA المرتبطة والمكتشفة حديثاً.

تعتمد هذه المنهجية السريعة على سلالة من الخميرة تعبر بشكل مشترك عن mRNA مُوسوم بـ MS2 وبروتين اندماجي يتكون من بروتين رابط لـ MS2 وبروتين رابط لـ streptavadin. يتم استنبات 500 milliliters من خلايا الخميرة عند 30 degrees Celsius في وسط dextrose اصطناعي أو وسط SD الانتقائي حتى تصل قيمة OD600 إلى 0.8 إلى 1.0. وعندما تصبح الخلايا جاهزة، تُفصل بالطرد المركزي عند 3000 ×g لمدة 4 minutes في درجة حرارة الغرفة، ثم يتم التخلص من الراشح.

اغسل الخلايا في PBS ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى. تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في حجم مساوٍ من SD الخالي من الميثيونين. قم بالتحضين لمدة تتراوح من 45 إلى 60 دقيقة عند 30 degrees celcius لتحفيز تعبير البروتين الاندماجي.

بعد مرور 45 إلى 60 دقيقة، اعزل 10 milliliters من الخلايا لاستخلاص RNA واستخدم الخلايا المتبقية للتنقية السريعة. لبدء هذا الإجراء، أضف إلى الخلايا 1.35 milliliters من 37% formaldehyde، لتصل إلى تركيز نهائي قدره 0.1% من أجل ربط معقدات RNA-protein تشابكيًا. استمر في الحضن عند 30 degrees Celsius لمدة 10 دقائق.

لإيقاف عملية الربط التشابكي، أضف 26.5 milliliters من الجلايسين بتركيز 2.5 molar، ليصل التركيز النهائي إلى 0.125 molar، ثم حضّن المزيج عند 30 degrees Celsius لمدة 3 minutes. ومن هذه الخطوة فصاعداً، يُحفظ كل شيء على الثلج ويتم العمل بسرعة لتقليل تحلل الـ RNA. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 3000 ×g لمدة 4 minutes عند 4 degrees Celsius.

تخلص من الطافي، وأضف 45 milliliters من PBS البارد، ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى. أزل الطافي وأعد تعليق الخلايا في 5 milliliters من منظم التحلل السريع الذي يحتوي على تركيز عالٍ من مثبطات Rnase. قسم معلق الخلايا إلى حصص قدرها 500 microliters في أنابيب طرد مركزي دقيقة ذات أغطية لولبية، وأضف حوالي 400 milligrams من الخرز الزجاجي المبرد إلى كل حصة.

قم بتحليل الخلايا باستخدام جهاز التحليل بالخرز (bead-beater) لمدة ثلاث دقائق. ضع المستخلص فوراً على الثلج. ثم انقل المستخلص إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة (microfuge tubes) جديدة.

اقطع الجزء العلوي من محقنة سعة 5 milliliter وضعها على أنبوب فارغ سعة 15 milliliter لتعمل كمحول للأنابيب ذات الغطاء اللولبي. استخدم إبرة ساخنة لثقب فتحة صغيرة في قاع كل أنبوب وضعها فوق أنابيب الـ 15 milliliter المعدلة. قم بطرد مركبات الأنابيب بجهاز الطرد المركزي بسرعة 3000 ×g لمدة دقيقة واحدة عند درجة حرارة 4 degrees Celsius لاستخلاص المادة المتحللة إلى أنابيب الـ 15 milliliter.

انقل السائل المار من كل أنبوب سعة 15 milliliter إلى أنبوب جديد سعة 1.5 milliliter، ثم قم بالطرد المركزي عند 10,000 ×g لمدة 10 دقائق عند 4 درجة مئوية للتخلص من حطام الخلايا. اجمع الرائق من جميع أنابيب 1.5 milliliter في أنبوب واحد سعة 15 milliliter. خصص 1/50 و1/100 من حجم المحلل لعزل RNA والبروتين على التوالي.

ابدأ الإجراء السريع لفصل معقدات البروتين RNA عن طريق إضافة 300 micrograms من Avidin إلى محلول التحلل الخلوي. قم بالتحضين لمدة 30 دقيقة عند 4 degrees Celsius مع التدحرج المستمر. وأثناء تحضين محلول التحلل الخلوي مع Avidin، قم بالغسيل المسبق لحبيبات streptavidin، وانقل حوالي 300 microliters من معلق حبيبات streptavadin إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliters، ثم قم بإجراء الطرد المركزي للمحضّر، وبعد ذلك أزل الطافي العلوي للحصول على 250 microliters من الحبيبات.

أضف 1 milliliter من منظم التحلل السريع (rapid lysis buffer) إلى الخرزات، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 660 ×g لمدة دقيقتين عند درجة حرارة 4 degrees Celsius. تخلص من السائل الطافي واغسل الخرزات مرة أخرى باستخدام منظم التحلل السريع. ولحجب الخرزات، أضف 0.5 milliliters من منظم التحلل السريع، و0.5 milliliters من BSA، و10 µL من yeast TRNA، ثم احضن المزيج لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 4 degrees Celsius مع التدوير المستمر.

اغسل الخرزات مرتين باستخدام 1 milliliter من منظم التحلل السريع. أضف 250 microliters من خرزات الستريبتفيدين المغسولة مسبقاً إلى المستخلص الذي يحتوي على الأفيدين، واتركه للحضن لمدة 1 hour عند 4 degrees Celsius مع التدوير المستمر. تعتبر مدة الحضن هذه حلاً وسطاً بين توفير وقت ربط كافٍ وتقليل فرص تحلل RNA.

بعد مرور ساعة واحدة، قم بالطرد المركزي بسرعة 660 ×g لمدة دقيقتين عند درجة حرارة 4 degrees Celsius لتصفية حبيبات الستربتافيدين. انقل السائل الطافي إلى أنبوب سعة 15 milliliter. خصص 1/50 و1/100 من حجم المستخلص لعزل الـ RNA والبروتين على التوالي.

أضف 1 milliliter من محلول التحلل السريع (rapid lysis buffer) إلى الخرزات. اخلط المزيج بواسطة الماصة، ثم انقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 milliliter، واجعله يدور بجهاز الطرد المركزي عند 660 ×g لمدة 2 minutes في درجة حرارة 4 °C. اغسل الخرزات ثلاث مرات إضافية باستخدام محلول التحلل السريع.

بعد الغسلة الأخيرة باستخدام منظم التحلل السريع (rapid lysis buffer)، تخلص من supernatant، ثم أضف 1 milliliter من منظم الغسيل السريع (rapid wash buffer)، وقم بالتدوير لمدة 5 minutes عند 4 degrees Celsius. قم بالطرد المركزي والغسل مرتين إضافيتين باستخدام منظم الغسيل السريع. اغسل الخرزات باستخدام 1 milliliter من PBS وقم بالطرد المركزي كما سبق.

قم بإزالة السائل الطافي، وأضف إلى الخرز 120 µL من PBS، ثم قم بتدوير المزيج لمدة 5 دقائق باستخدام جهاز الدوران (roller). قم بإجراء عملية الطرد المركزي كما في السابق واجمع كل السائل الطافي كعينة غسيل لاستخلاص RNA والبروتين. لاستخلاص RNA والبروتينات المرتبطة به، أضف 120 µL من البيوتين بتركيز 6 mM في PBS إلى الخرز، ثم قم بالتحضين لمدة 45 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C مع التدوير المستمر.

قم بطرد الخرزات مركزياً وانقل المادة المستخلصة إلى أنبوب جديد سعة 1.5 milliliter. قم بطرد العينة المستخلصة مركزياً مرة أخرى وانقل الطور العلوي إلى أنبوب جديد سعة 1.5 milliliter لضمان عدم انتقال أي من الخرزات. خذ عينات لاستخلاص RNA أو البروتين.

لتحديد كفاءة عزل الحمض النووي الريبوزي (RNA) وجودته، أُجري تحليل نورثرن (Northern Analysis) لنوعين من الحمض النووي الريبوزي الموسوم هما PMP1 وFPR1، المستخلصين من تحلل الخلايا بالصب (cast cell lysis)، والتحلل الخلوي السريع (rapid cell lysis)، وبعد الشطف باستخدام البيوتين. تم الكشف عن الأحماض النووية الريبوزية الريبوسومية عن طريق الصبغ ببروميد الإيثيديوم، ويشير غياب الأحماض النووية الريبوسومية في عينة الشطف إلى صرامة عملية التنقية.

يتم إثبات صرامة وخصوصية عملية التنقية بشكل أكبر من خلال غياب إشارة لـ MRNA غير مُوسوم في عينات الشطف. أما الإشارة الظاهرة في مسار FPR1، والتي لا تماثل حجم ACT1، فهي بقايا من عملية تهجين سابقة باستخدام مسبار MS2L. وبالرغم من أن الـ RNA المدخل مُتحلل بدرجة أكبر نوعاً ما مقارنة بالـ RNA الذي تم تنقيته بواسطة بروتوكول الفينول الساخن (Hot Phenol)، فقد تم عزل كمية كبيرة من الـ RNA المُوسوم كامل الطول بشكل محدد، كما يتضح من الإشارة القوية في كسور الشطف.

يمكن تحليل عينات البروتين بواسطة الفصل الكهربائي للهلام بوجود SDS-PAGE والتلوين بالفضة قبل إجراء تحليل البروتيوميات. يظهر البروتين الاندماجي MS2-CP-GFP-SBP، والمشار إليه بالسهم، تحميلًا متساويًا للبروتين. وتشير النجمات إلى حزم ذات شدة متفاوتة تم قصها لاحقًا من الهلام لتحليلها بواسطة مطياف الكتلة.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم ارتداء القفازات، وضمان نظافة منطقة العمل، وتحضير المحلول باستخدام ماء خالٍ من الـ RNA، والعمل بسرعة وكفاءة لتقليل وقت البروتوكول. ولا تنسَ أن التعامل مع كواشف مثل الفينول والفورمالديهايد يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا يجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل العمل داخل خزانة استخلاص كيميائية (chemical hood)، دائماً عند تنفيذ هذا الإجراء. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنقية الـ RNA الخاص بـ fayn-tress والجسم المرتبط به بكفاءة وفعالية.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل RNA-Seq من أجل الكشف عن جزيئات الـ RNA التي ترتبط بالنسخة الجينية المستهدفة.