رواية عزل-ملزم RNA والبروتينات التي السريع المنهجية

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الحمض النووي الريبي المعين بكفاءة مع البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي في الجسم الحي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في استقلاب الحمض النووي الريبي وتنظيمه ، مثل مجموعة مميزة من بول نحلة الفو المرتبطة بنسخة معينة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الكفاءة العالية للعزل ، والتي تسمح بمتابعة تحديد البروتينات المرتبطة بالرنا المرسال النبيل.

تستخدم المنهجية السريعة سلالة الخميرة التي تشارك في التعبير عن MRNA الموسوم ب MS2 وبروتين اندماج لبروتين ربط MS2 وبروتين ربط Streptavadin. تنمو 500 مل من خلايا الخميرة عند 30 درجة مئوية في سكر العنب الاصطناعي أو وسط SD الانتقائي إلى OD600 من 0.8 إلى 1.0. عندما تكون الخلايا جاهزة ، قم بجهاز الطرد المركزي عند 3000 مرة جم لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من المادة الطافية.

اغسل الخلايا في PBS وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا بحجم متساو من SD بدون ميثيونين. احتضن لمدة 45 إلى 60 دقيقة عند 30 درجة مئوية للحث على التعبير عن بروتين الاندماج.

بعد 45 إلى 60 دقيقة ، ضع جانبا 10 ملليلتر من الخلايا لاستخراج الحمض النووي الريبي واستخدم الخلايا المتبقية للتنقية السريعة. لبدء هذا الإجراء ، أضف إلى الخلايا 1.35 مل من 37٪ فورمالديهايد ، إلى تركيز نهائي قدره 0.1٪ لربط مجمعات بروتين الحمض النووي الريبي. استمر في الحضانة عند 30 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

لإيقاف الربط المتقاطع ، أضف 26.5 مل من 2.5 مولار جلايسين ، إلى التركيز النهائي 0.125 مولار ، واحتضن عند 30 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. من الآن فصاعدا ، احتفظ بكل شيء على الجليد واعمل بسرعة لتقليل تدهور الحمض النووي الريبي. الطرد المركزي للخلايا عند 3000 مرة G لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية.

تخلص من المادة الطافية ، وأضف 45 مل من PBS البارد ، وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 5 ملليلتر من محلول التحلل السريع الذي يحتوي على تركيز عال من مثبطات الرناز. قسم تعليق الخلية إلى حصص 500 ميكرولتر في أنابيب ميكروفوج مغطاة بالمسمار وأضف ما يقرب من 400 ملليغرام من حبات الزجاج المبردة إلى كل حصة.

قم بتقطيع الخلايا في مضرب الخرز لمدة ثلاث دقائق. ضع المحللة على الفور على الجليد. انقل المحللة إلى أنابيب ميكروفوجوج جديدة.

قم بقص الجزء العلوي من حقنة سعة 5 ملليلتر وضعها على أنبوب فارغ سعة 15 مليلتر ليكون بمثابة محول لأنابيب الغطاء اللولبي. استخدم إبرة ساخنة لثقب ثقب صغير في قاع كل أنبوب ووضعه فوق أنابيب 15 ملليلتر المعدلة. قم بالطرد المركزي لتجميعات الحوض عند 3000 مرة G لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية لمسح المحللة إلى أنابيب 15 ملليلتر.

انقل التدفق من كل أنبوب سعة 15 مليلتر إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند 10,000 مرة G لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة بقايا الخلية. قم بتجميع المادة الطافية من جميع الأنابيب سعة 1.5 مليلتر في أنبوب واحد سعة 15 ملليلترا. ضع جانبا 1/50 و 1/100 من المجلد من المحللة لعزل الحمض النووي الريبي والبروتين على التوالي.

ابدأ الإجراء السريع لعزل مجمعات بروتين الحمض النووي الريبي عن طريق إضافة 300 ميكروغرام من أفيدين إلى محللة الخلية. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية تحت التدحرج المستمر. أثناء تحضين محللة الخلية باستخدام Avidin ، اغسل حبات الستربتافيدين مسبقا ، وانقل حوالي 300 ميكرولتر من ملاط حبة Streptavadin ليزن 1.5 مل أنبوب microcentriuge ، وقم بالطرد المركزي للمستحضر ، ثم قم بإزالة المادة الطافية العلوية التي سينتج عنها 250 ميكرولتر من الخرز.

أضف 1 مليلتر من المخزن المؤقت للتحلل السريع إلى الخرزات وأجهزة الطرد المركزي عند 660 مرة G لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية واغسلها مرة أخرى باستخدام محلول تحلل سريع. لمنع الخرزات ، أضف 0.5 مل من المخزن المؤقت للتحلل السريع ، و 0.5 مل من BSA ، و 10 ميكرولتر من خميرة TRNA واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية مع دوران مستمر.

اغسل الخرزات مرتين باستخدام 1 مليلتر من محلول التحلل السريع. أضف 250 ميكرولتر من حبات الستربتافيدين المغسولة مسبقا إلى أفيدين المحتوية على الليزات واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية مع دوران مستمر. يعد وقت الحضانة هذا حلا وسطا بين توفير وقت ربط كاف وتقليل فرص تدهور الحمض النووي الريبي.

بعد ساعة واحدة ، جهاز الطرد المركزي عند 660 مرة G لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية لمسح حبات الستربتافيدين. انقل المادة الطافية إلى أنبوب سعة 15 مل. ضع جانبا 1/50 و 1/100 من المجلد من المحللة لعزل الحمض النووي الريبي والبروتين على التوالي.

أضف 1 مليلتر من المخزن المؤقت للتحلل السريع إلى الخرز. امزج عن طريق سحب العينة ، وانقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مليلتر وجهاز طرد مركزي عند 660 مرة جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. اغسل ثلاث مرات أخرى باستخدام عازلة التحلل السريع.

بعد الغسيل النهائي باستخدام محلول التحلل السريع ، قم بإزالة المادة الطافية ، وأضف 1 ملليلتر من محلول الغسيل السريع ، وقم بتدويرها لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. جهاز طرد مركزي وغسل 2 مرات أخرى مع مخزن مؤقت الغسيل السريع. اغسل الخرزات ب 1 مليلتر من PBS وأجهزة الطرد المركزي كما كان من قبل.

قم بإزالة المادة الطافية ، وأضف إلى الخرزات 120 ميكرولتر من PBS ، وقم بتدويرها لمدة 5 دقائق في بكرة. جهاز الطرد المركزي كما كان من قبل وجمع كل المواد الطافية لاستخراج الحمض النووي الريبي والبروتين كعينة غسيل. لتصفية البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبي ، أضف 120 ميكرولترا من 6 ملليمولار البيوتين في PBS إلى الخرز ، واحتضن لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية مع دوران مستمر.

الطرد المركزي للحبات ونقل المواد المراوغة إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل. قم بتدوير العينة المملوءة مرة أخرى وانقل المرحلة العليا إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مليلتر لضمان عدم ترحيل الخرز. خذ عينات لاستخراج الحمض النووي الريبي أو البروتين.

لتحديد كفاءة عزل وجودة الحمض النووي الريبي ، تم إجراء التحليل الشمالي لاثنين من الحمض النووي الريبي الموسوم. PMP1 و FPR1 ، من تحلل الخلايا المصبوبة ، والتحلل السريع للخلايا ، وبعد الشطف بالبيوتين. تم الكشف عن الحمض النووي الريبوزومي عن طريق تلطيخ بروميد الإيثيديوم ، ويشير نقص الحمض النووي الريبوسومي في عينة الشطف إلى صرامة التنقية.

يتم إثبات صرامة وخصوصية التنقية أيضا من خلال عدم وجود إشارة إلى MRNA غير الموسوم في عينات الشطف. الإشارة الظاهرة في حارة FPR1 ، والتي ليست بحجم ACT1 ، هي بقايا من التهجين السابق باستخدام مسبار MS2L. على الرغم من أن الحمض النووي الريبي المدخل أكثر تدهورا إلى حد ما مقارنة بالحمض النووي الريبي الذي تم تنقية بواسطة بروتوكول Hot Phenol ، إلا أنه يتم عزل كمية كبيرة من الحمض النووي الريبي الموسوم بطول كامل على وجه التحديد ، كما يتضح من الإشارة القوية في كسور الشطف.

يمكن تحليل عينات البروتين بواسطة SDS-PAGE وصبغة الفضة قبل تحليل البروتينات. يوضح بروتين الاندماج MS2-CP-GFP-SBP ، المشار إليه بالسهم ، تحميل البروتين المتساوي. تشير العلامات النجمية إلى نطاقات ذات شدة تفاضلية تم قطعها لاحقا من الجل لتحليل قياس الطيف الكتلي.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم ارتداء القفازات ، وضمان منطقة عمل نظيفة ، وإعداد محلول بالماء الخالي من الحمض النووي الريبي ، والعمل بسرعة وكفاءة لتقليل وقت البروتوكول. لا تنس أن العمل مع الكواشف مثل الفينول والفورمالديهايد يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل العمل في غطاء كيميائي أثناء تنفيذ هذا الإجراء. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنقية الحمض النووي الريبي بكفاءة وفعالية من خصلة الفاين والجسم المرتبط بها.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل RNA-Seq من أجل اكتشاف الحمض النووي الريبي الذي يربط النص محل الاهتمام.