دمج المطلق والنسبي البيانات الكمية PCR لتحديد STAT3 لصق النصوص البديل
October 9th, 2016
الهدف العام لهذا البروتوكول هو تحديد النسب والمستويات المطلقة لنصوص لصق STAT3 المتغيرة في الحمضات. يمكن أن تعالج هذه الطريقة الأسئلة الرئيسية في مجال تنظيم التضفير مثل الارتباط المشترك لأحداث التضفير البعيد وتحديد الحالات التي يمكن أن تتسبب في اختلاف نسب التضفير الترادفي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي معايير البلازميد التي تتيح الحصول على بيانات qPCR المطلقة والنسبية حتى نتمكن من تحديد النسب والمستويات الإجمالية لأربعة نصوص STAT3.
في حالتنا ، نود أن نتعلم كيف تتغير متغيرات STAT3 الأربعة S alpha و S beta و delta S alpha و delta S beta عندما يتم تحفيز الحمضات بواسطة السيتوكينات. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتكوين الحمضات STAT3 ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنواع الخلايا الأخرى التي يمكن الحصول عليها (كدنا). نظرا لأن S و delta S يختلفان في ثلاثة نيوكليوتيدات فقط ، كان علينا التضحية بالكفاءة لتحقيق الخصوصية في أي من معايير المعايير لكل متغير.
في هذا البروتوكول ، يتم استخدام (كدنا) المحضر من الحمضات البشرية كقالب لتضخيم متغيرات لصق STAT3. بعد إنشاء البلازميدات كما هو موضح في بروتوكول النص ، قم بإعداد تفاعلات التسلسل لتسلسل البلازميدات من عدة مستعمرات. يجب أن يحتوي كل تفاعل سعة 20 ميكرولتر على ثلاثة ميكرولترات من المخزن المؤقت لتفاعل التسلسل ، وميكرولترين من مزيج تفاعل التسلسل ، و 12 ميكرولتر من الماء عالي النقاء ، وميكرولتر واحد من البلازميد ، وميكرولترين من التسلسل.
عندما تكون نتائج التسلسل متاحةقم بتقييم مخططات كهربية البلازميدات التي تشفر كل متغير. S alpha و S beta و delta S alpha و delta S beta. قم بقياس تركيز الحمض النووي البلازميد النقي بالنانوجرام لكل ميكرولتر واحسب رقم النسخة لكل ميكرولتر. ابدأ هذا الإجراء بإعداد سلسلة تخفيف واحدة من كل 10 من بلازميدات STAT3 باستخدام ماء فائق النقاء.
مع تقريبا 10 إلى الثامنة إلى 10 إلى النسخ الثالثة لكل ميكرولتر. قم بقياس تركيز العينة الأكثر تركيزا. استخدم البلازميدات المخففة لإعداد أربعة خلطات غير مستهدفة كعناصر تحكم سلبية لكل متغير لصق عند 10 إلى النسخ السادسة لكل ميكرولتر لكل متغير.
قم بإعداد مزيج مستهدف بتركيزات متساوية من جميع القوالب الأربعة ، كل منها بحجم 10 إلى سادس نسخ لكل ميكرولتر. قم بإعداد محاليل زوج أولية لكل متغير لصق مع 60 ميكرولترا من البادئات ، كل منها بتركيز سبعة ميكرومولار ، للتركيز النهائي البالغ 560 نانومولار في العينة. تمييع بوليميراز الحمض النووي ، مزيج صبغة ربط الحمض النووي مزدوج الشريطة ، من سبعة إلى خمسة بالماء النقي.
قم بإعداد الاختبار في لوحة PCR سعة 96 بئرا باتباع هذا القالب. أضف أولا إلى كل بئر 21 ميكرولترا من بوليميراز الحمض النووي المخفف ، مزيج صبغة ربط الحمض النووي مزدوج الشريطة. ثم أضف ميكرولترين من مزيج التمهيدي وميكرولترين من القالب.
أضف إلى كل بئر تحكم بدون قالب ميكرولتر من الماء المصفى بدلا من القالب. قم بإعداد التفاعلات بشكل مكرر لتقييم قابلية التكرار. أغلق لوحة qPCR بغطاء لاصق وجهاز طرد مركزي لمدة خمس دقائق عند 1,200 جم عند 12 درجة مئوية.
قم بتشغيل جهاز qPCR وأدخل لوحة qPCR المختومة. إذا كنت تستخدم نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي ABI ، فقم بإعداد التجربة كما هو موضح. انقر على ملف، جديد، التالي، حدد كاشف جديد، ثم أدخل اسما واختر مراسلا ومروي.
قم بإعداد كاشف جديد لكل متغير لصق. حدد التالي وقم بإعداد المعايير كما هو مطلوب في صفحة إعداد لوحة العينة لضمان إدخال الكميات في الجدول وتحديد أجهزة الكشف المناسبة. انقر فوق إنهاء.
قم بإعداد برنامج ركوب الدراجات PCR المناسب. تأكد من أن قراءة التألق لتحديد قيم دورة العتبة تحدث خلال خطوة 72 درجة مئوية من كل دورة. حدد تشغيل.
عند اكتمال التشغيل، انقر فوق علامة التبويب النتائج علامة التبويب مخطط تضخيم. قم بتقييم مخطط تضخيم الإخراج لتقييم جودة البيانات. تشير المؤامرة الأسية إلى تضخيم موثوق.
تصدير النتائج إلى برنامج جدول بيانات. يعد تحليل البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص أمرا أساسيا لمعرفة ما إذا كان الاختبار يتطلب مزيدا من التحسين من أجل التكاثر. يتم تحضير (كدنا) لهذا الاختبار من الحمضات المعالجة بالسيتوكينات لتعزيز النسخ.
قم بإعداد تخفيفات تسلسلية لعينة من حصصات (كدنا) مع نطاق تخفيف من واحد إلى واحد في 1 ، 024. قم بإعداد الاختبار في صفيحة سعة 96 بئرا مع تفاعلات 25 ميكرولتر كما هو موضح لتحليل خصوصية التمهيدي ولكن مع العديد من التركيزات التمهيدية ل pan STAT3 وجين التدبير المنزلي GUSB. يتم عرض قالب في هذا الجدول.
أدخل لوحة PCR المختومة في جهاز qPCR. قم بإعداد التجربة باستخدام البرنامج مع إضافة كاشف جديد ل GUSB واستخدام برنامج تدوير PCR المناسب. بعد ذلك ، يتم استخدام النتائج لحساب قيمة دورة العتبة لكل عينة كما هو موضح في بروتوكول النص.
لبدء هذا الإجراء ، قارن قيم دورة العتبة التي تم الحصول عليها في qPCR النسبي لجين التدبير المنزلي GUSB وقم بتخفيف (كدنا) وفقا لذلك بالماء عالي النقاء للتأكد من أن جميع التركيزات ضمن ترتيب واحد من حيث الحجم. قم بإعداد فحوصات qPCR المطلقة للعينات في ألواح 96 بئرا. اتبع هذا القالب ل S ألفا و S بيتا وهذا القالب لدلتا S ألفا ودلتا S بيتا.
قم بإجراء المقايسات كما هو موضح سابقا وكرر المقايسات مرة واحدة على الأقل. بعد ذلك ، قم بإعداد لوحة qPCR 96 بئر مطلقة مع تفاعلات 25 ميكرولتر باستخدام بادئات عموم STAT3 عند 400 ميكرومولار ومزيج من جميع البلازميدات الأربعة أو بلازميد واحد باتباع هذا القالب. أغلق لوحة qPCR بغطاء لاصق وجهاز طرد مركزي لمدة خمس دقائق عند 1,200 جم عند 12 درجة مئوية.
أدخل لوحة PCR محكمة الغلق في جهاز qPCR وقم بإعداد التجربة كما هو موضح سابقا مع إضافة كاشف جديد للعموم STAT3. قم بإعداد نفس معلمات التدوير الخاصة ب qPCR النسبي. بعد تكرار الفحص ، قم بتحليل النتائج مرة واحدة على الأقل كما هو موضح في بروتوكول النص.
ستولد بيانات qPCR عالية الجودة مخططا تضخيما سينيا يدل على زيادة هائلة في النصوص على مدار ركوب الدراجات. تم الحصول على هذه البيانات من qPCR لمخففين تسلسليين من البلازميد المحتوي على STAT3 S alpha. يمثل كل زوج من الخطوط الملونة مستويات التألق للعينات المخففة المكررة على مدار 40 دورة.
ستشير المنحنيات القياسية التي تم إنشاؤها لبلازميدات معاير القالب إلى كفاءة التضخيم. في هذا المنحنى ل STAT3 S alpha ، كانت كفاءة التضخيم 83.9٪ من أجل تقييم تطابق مستويات STAT3 ، تم قياس القيم المطلقة لكل من متغيرات لصق الأربعة بالإضافة إلى مستوى STAT3 الإجمالي. من الناحية المثالية ، يجب أن يكون كل من الانحدار الخطي والمنحدر قريبين من واحد.
يتم تقديم بيانات qPCR المطلقة كمخططات دائرية لإظهار نسبها من متغيرات لصق STAT3 الأربعة على مدار علاج السيتوكين. أظهر دمج بيانات qPCR المطلقة والنسبية أن مستويات جميع متغيرات لصق STAT3 زادت من التحفيز اللاحق باستخدام السيتوكينات IL3 و TNF alpha مع مستويات تصل إلى ذروتها في ست ساعات. كشف تجميع البيانات من جميع النقاط الزمنية عن تحيز صغير ولكنه مهم للارتباط المشترك لأحداث التضفير التجريبية والدلتا.
بمجرد التحسين ، يمكن إجراء المقايسات المستندة إلى هذه التقنية في غضون أربع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر العمل في ظل ظروف معقمة لمنع التلوث. تمثل قرارات الربط التي تتضمن أو تستبعد كودون واحد 20٪ من تباين لصق الإطار.
يجب أن يكون بروتوكولنا قابلا للتكيف بسهولة مع القياس الكمي لمثل هذه الاختلافات. بعد تطويرها ، سمحت هذه التقنية لماو تشانغ بالعمل مع مجموعتي في مجموعة Li-Shan Rue للتحكم في تجارب إعادة التعبير بالضربة القاضية لمتغيرات STAT3 في خلايا سرطان الغدد الليمفاوية ABC. أظهرت هذه التجارب أن مزيجا من متغيرات S و delta S مطلوب لبقاء الخلية في الثقافة.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء qPCR المطلق والنسبي والظروف المناسبة لتمييز وقياس اختلافات التضفير الدقيقة.
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة لتحديد نسب ومستويات المطلق لنصوص متغيرات الربط البديل لـ STAT3 في الخلايا الحمضية. يستفيد البروتوكول من تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي المطلق لتحليل متغيرات الربط الناتجة عن أحداث الربط المتتابع.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلية
- البيولوجيا الجزيئية
الخلفية
- تحدث أحداث الربط المتتابع في مواقع تفصل بينها أقل من 12 نيوكليوتيد.
- تحديد نسب متغيرات الربط ضروري لفهم تنظيم الجينات.
- تشمل متغيرات الربط لـ STAT3 S alpha، S beta، delta S alpha، وdelta S beta.
- يمكن أن يوفر فهم هذه المتغيرات رؤى حول وظيفة الخلايا الحمضية والاستجابة للسيتوكينات.
غرض الدراسة
- تحديد نسب متغيرات الربط لـ STAT3 في الخلايا الحمضية.
- التحقيق في كيفية تأثير التحفيز السيتوكيني على التعبير عن هذه المتغيرات.
- توفير طريقة موثوقة لتقييم نسب متغيرات الربط.
الطرق المستخدمة
- تحضير الحمض النووي الريبي المتمم من الخلايا الحمضية البشرية.
- استخدام معايير البلازميد للحصول على بيانات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي المطلق والنسبي.
- تفاعلات التسلسل لتقييم هياكل البلازميد لكل متغير ربط.
- إعداد مقايسات تفاعل البوليميراز المتسلسل في شكل 96 بئرًا لتحليل مستويات النصوص.
النتائج الرئيسية
- تحديد ناجح لأربعة متغيرات ربط لـ STAT3.
- تبيين التغييرات في نسب متغيرات الربط عند التحفيز السيتوكيني.
- توفير طريقة قابلة للتطبيق على أنواع خلوية مختلفة لتحليل متغيرات الربط.
- أشارت البيانات إلى الحاجة إلى تحسين قابلية تكرار المقايسة.
الاستنتاجات
- تقوم الطريقة بشكل فعال بتحديد نسب متغيرات الربط لـ STAT3 في الخلايا الحمضية.
- يمكن أن تعزز الرؤى المكتسبة فهم تنظيم الربط.
- يمكن تكييف هذه الطريقة لأنواع خلوية وظروف أخرى.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of splice variant proportions enables mechanistic de-risking in target validation by resolving transcriptional heterogeneity that can confound functional assays. This approach supports predictive confidence in lead identification by linking isoform-specific expression to phenotypic outcomes in disease-relevant systems. The method’s adaptability to tandem splicing sites offers a scalable strategy for early discovery workflows where subtle transcriptional changes inform go/no-go decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional hypotheses by quantifying isoform-specific expression changes in response to cytokine stimulation.
- Operational Value: Provides absolute quantification via plasmid standards, reducing reliance on comparative methods that may introduce normalization bias.
- Predictive Value: Supports assessment of co-splicing interdependence, aiding in the prioritization of targets with coordinated regulatory mechanisms.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, reproducibility-ready data for four highly similar splice variants, enabling precise discrimination in multiplexed assays.
- Operational Value: Establishes standardized workflows using calibrated plasmid dilutions, facilitating cross-lab consistency in transcript quantification.
- Scalability: Compatible with 96-well qPCR formats, allowing medium-throughput screening of splice variant dynamics under experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links eosinophil STAT3 isoform shifts to cytokine exposure, providing a disease-relevant system for inflammatory pathway analysis.
- Mechanistic De-risking: Reveals co-splicing patterns between distal tandem sites, informing biomarker strategies that account for coordinated transcriptional regulation.
- Preclinical Model Relevance: Demonstrated adaptability to lymphoma cells, supporting cross-system validation of splice variant functional roles.
Pipeline & Workflow Integration
The method bridges discovery biology and lead identification by delivering absolute and relative transcript data that inform both target validation and assay readiness stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of splicing regulation by quantifying isoform-specific responses to stimuli, clarifying pathway-level effects.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs from absolute qPCR, enabling reliable comparison of splice variant proportions across conditions.
- Analytics: Combines absolute quantification with efficiency-corrected relative qPCR to derive both proportional and total transcript levels, enhancing data interpretability.
- Translational Research: Connects isoform dynamics in primary eosinophils to preclinical models, supporting continuity in target validation.
- Enterprise Reuse: Plasmid-based standardization allows the assay to be reused across projects and cell types as a plug-and-play quantification module.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving isoform-specific expression, improving target confidence in STAT3-related pathways.
- Operational Value: Ensures reproducibility through plasmid standard curves and optimized cycling parameters, minimizing inter-assay variability.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by linking splice variant ratios to functional outcomes in cellular models.
- Portfolio Impact: Enables data-driven triage of targets based on isoform expression stability and co-splicing behavior under pathophysiological conditions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in qPCR optimization, plasmid preparation, and sequence validation to ensure splice variant specificity.
- Dependent on access to qPCR instrumentation with fluorescence detection and thermal cycling precision for accurate threshold cycle determination.
- Necessitates cross-team standardization of plasmid dilution series and primer concentration protocols to maintain assay comparability.
- Involves adaptation considerations when transferring the method to new cell types, including cDNA quality and transcript abundance thresholds.
- Practical limitation: Primer specificity must be balanced with amplification efficiency due to minimal nucleotide differences between variants, as noted in the protocol optimization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:16
Creating Plasmids as Template Standards
2:20
Analyzing Primer Specificity for Absolute qPCR
5:49
Performing Relative qPCR Assays
6:57
Analyzing Absolute qPCR Data for Unknown Samples
8:27
Results: Measurement of STAT3 Splice Variant Levels in Eosinophils Treated with Cytokines
10:06
Conclusion
