الكشف عن تعتمد على درجة الحموضة آخر من كولاي الوصيفة HdeB في المختبر و في فيفو

الهدف العام من فحوصات مرافقة في الجسم الحي وفي المختبر هو توصيف النشاط المعتمد على الأس الهيدروجيني للإشريكية القولونية مرافق HdeB في ظل ظروف الأس الهيدروجيني الحمضية. لدى المرافقين المنشطين بالحمض مهمة واحدة فقط للقيام بها ، فهم بحاجة إلى حماية البروتينات من البروتين الناجم عن الحمض وتحلل. هذه الوظيفة مهمة بشكل خاص للبكتيريا المعوية, التي يجب أن تنجو على قيد الحياة في البيئة الحمضية للمعدة إذا كانوا يريدون استعمار القناة الهضمية بنجاح.

تسمح لك الطرق التي نقدمها هنا بتحديد وتوصيف المرافقين المنشطين بالحمض ، وتحديد ظروف الأس الهيدروجيني التي تؤدي إلى تنشيطها. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توصيف المرافقين ، مثل HdeB في المختبر وفي الجسم الحي ، مما يساعدك على فك تشفير آلية تنشيطه. تم تطبيق هذه الطرق بنجاح على مرافقين واقيين آخرين من الأحماض ، مثل HDA ، ويمكن تعديلها بشكل أكبر للعمل مع المرافقين الآخرين و / أو ظروف الإجهاد.

يتم مراقبة تأثير HdeB المنقى على تجميع نازعة هيدروجين مالات الميتوكوندريا الخنازير التي تتكشف حراريا عند قيم الأس الهيدروجيني المختلفة. غسيل MDH عند أربع درجات مئوية طوال الليل مقابل أربعة لترات من العازلة C. ثم قم بتركيز البروتين إلى ما يقرب من 100 ميكرومولار باستخدام وحدات مرشح الطرد المركزي مع قطع الوزن الجزيئي 30 كيلو دالتون. لإزالة الركام ، قم بالطرد المركزي للبروتين لمدة 20 دقيقة عند 20،000 مرة جم عند أربع درجات مئوية.

تحديد تركيز MDH عن طريق الامتصاص عند 280 نانومولار. ثم قم بإعداد 50 لتر ميكرو من MDH وقم بتجميد الحصص للتخزين. ضع كوفيت كوارتز سعة واحدة ملليلتر في مقياس الطيف الضوئي الفلوري المجهز بحاملات عينات يتم التحكم في درجة حرارتها وأدوات التقليب.

اضبط الطول الموجي للإثارة والقبول على 350 نانومتر. أضف الأحجام المناسبة من المخزن المؤقت D المسخن مسبقا عند قيم الأس الهيدروجيني المطلوبة إلى الكوفيت. الحجم الإجمالي هو 1 ، 000 ميكرولتر.

اضبط درجة الحرارة في حامل الكوفيت على 43 درجة مئوية. أضف 12.5 ميكرومولار HdeB إلى المخزن المؤقت ، متبوعا بإضافة 0.5 ميكرومولار MDH. ابدأ في مراقبة تشتت الضوء.

احتضان التفاعل لمدة 360 ثانية للسماح بالكشف الكافي عن MDH. ارفع الرقم الهيدروجيني إلى سبعة عن طريق إضافة حجم 0.16 إلى 0.34 من فوسفات ثنائي البوتاسيوم غير المخزن بالمولير، واستمر في تسجيل تشتت الضوء لمدة 440 ثانية أخرى. تحليل البيانات كما هو موضح في بروتوكول النص.

قم بتحويل البلازميد الذي يعبر عن HdeB أو التحكم في ناقلات MD ، PBAD 18 ، إلى سلالة BB7224 Delta RPOH باستخدام خلايا مختصة كيميائيا. هذه السلالة حساسة لدرجة الحرارة ويجب زراعتها عند 30 درجة مئوية. بعد 45 ثانية من الصدمة الحرارية عند 42 درجة مئوية وقبل الطلاء ، احتضان الخلايا عند 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة.

قم بإجراء عمليات استخلاص لمستعمرة واحدة من المستنسخة الإيجابية ، واحتضانها طوال الليل عند 30 درجة مئوية. قم بإعداد مزرعة ليلية في 50 مل من LB مع الأمبيسلين ، وقم بزراعة الخلايا عند 200 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية. خفف على الثقافات الليلية 40 ضعفا إلى 25 ملليلتر من LB مع الأمبيسلين.

قم بزراعة البكتيريا في وجود 0.5٪ أرابينوز عند 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر ، أو OD 600 يساوي 1.0 ، للحث على التعبير عن بروتين HDEB. بالنسبة لتجارب تحول الأس الهيدروجيني ، استخدم LB مع الأمبيسلين والأرابينوز لتخفيف الخلايا إلى OD 600 من 0.5. اضبط قيم الأس الهيدروجيني المعنية عن طريق إضافة أحجام مناسبة من خمسة حمض هيدروكلوريك مولاري.

بعد النقاط الزمنية المحددة ، قم بتحييد الثقافات عن طريق إضافة الأحجام المناسبة من خمسة هيدروكسيد الصوديوم المولاري. مراقبة نمو المزارع المعادلة والثقافة السائلة لمدة 12 ساعة عند 30 درجة مئوية باستخدام قياسات OD. للتحقيق في الأس الهيدروجيني الأمثل لنشاط مرافق HdeB في المختبر ، تم تخفيف MDH الأصلي إلى مخزن مؤقت مسخن مسبقا للرقم الهيدروجيني المشار إليه في الوجود أو الغياب أو HdeB.

بعد 360 ثانية من الحضانة ، تم تشغيل تجميع MDH عند 43 درجة مئوية من خلال التحييد. في وجود HdeB ، تنخفض إشارة تشتت الضوء بشكل كبير عند التحييد من الأس الهيدروجيني الرابع ، مما يشير إلى أن HdeB يمنع تجميع MDH. قياسات التجميع حساسة للغاية للتغيرات في درجة الحرارة أو محتوى المخزن المؤقت.

للقضاء على النتائج الإيجابية الخاطئة ، تم التحقيق في تأثير مخزن تخزين المرافق على تجميع العميل. لم يكن للمخزن المؤقت لتخزين HdeB أي تأثير على تجميع MDH. للتحقيق في تأثيرات HdeB في الجسم الحي ، تم إجراء فحوصات البقاء على قيد الحياة المعتمدة على الأس الهيدروجيني باستخدام سلالة حذف RPOH الحساسة لدرجة الحرارة.

تفتقر هذه السلالة إلى معظم المرافقين ، وبالتالي فهي أكثر عرضة لارتفاع درجة الحرارة أو انخفاض درجة الحموضة أو الإجهاد المؤكسد. لم يظهر التعبير الزائد عن HdeB في ظل ظروف الأس الهيدروجيني المحايدة أي تأثير على معدل نمو السلالة ، والتي نمت بشكل جيد مقارنة بسلالة التحكم التي تؤوي المتجه الفارغ ، PBAD 18. في المقابل ، تم العثور على اختلافات واضحة في قدرتها على استئناف النمو عند معالجات الأس الهيدروجيني الثالث أو أربعة الأس الهيدروجيني ، حيث أظهر HdeB على الإجهاد المعبر عن تعافيه بشكل متكرر من معالجة الأس الهيدروجيني المنخفض مقارنة بسلالة التحكم.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء التنقية في ثلاثة أيام ، ومقايسة التشتت في المختبر في يوم واحد ، وفحوصات البقاء على قيد الحياة في الجسم الحي في غضون يومين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. عند إجراء هذه التجارب ، تأكد من التفكير في تصميمك التجريبي بعناية ، سواء فيما يتعلق بنوع بروتينات العميل وتركيزاتها وظروف المخزن المؤقت التي تستخدمها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تساعد على اكتساب فهم أكثر تفصيلا حول آلية تنشيط المرافق وآثاره في سياق في الجسم الحي.

ولا تنس أن دراسة درجة الحموضة المثلى لمرافق واقي من الحمض يمكن أن تكون صعبة للغاية. وذلك لأن سلوك التجميع لبروتين العميل الذي تستخدمه من المحتمل أن يتغير أيضا مع الرقم الهيدروجيني. لذلك ، تأكد من اختيار أنظمة عازلة مناسبة لكل من المرافق وبروتين العميل.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل فحوصات الدوران بواسطة صفحة SCS ، في قمع تجميع العميل بوساطة المرافق الكمي تلقائيا.