تسليم الأحماض النووية من خلال حقن مكروي الأجنة في مكافحة الحشرات الحشرات الزراعية العالمية،

الهدف العام من هذا الإجراء هو إيصال الأحماض النووية إلى أجنة ذبابة فاكهة البحر المتوسط (*Ceratitis capitata*)، وهي آفة زراعية مهمة، وذلك لتوسيع مجموعة الأدوات المتاحة لمكافحتها في نهاية المطاف. تساعد هذه الطريقة في التصحيح الوظيفي للجينات في كائن غير متحرك، بالإضافة إلى توليد سلالات معدلة وراثياً. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن كميات قليلة جداً من الأحماض النووية يتم حقنها لتحقيق التأثيرات المرجوة.

حافظ على جميع مراحل حياة مستعمرة ذبابة الفاكهة المتوسطية عند درجة حرارة 25 °C مع رطوبة بنسبة 65% ودورة ضوئية تتكون من 12 ساعة إضاءة و 12 ساعة ظلام، بحيث تبدأ فترة الإضاءة في الساعة 8 صباحًا. أدخل شريطًا إسفنجيًا عبر فتحة صغيرة في قاعدة القفص لتزويد الذباب بالماء عن طريق الخاصية الشعرية. قم بتجهيز قفص سعة ستة لترات، وضع فيه ما بين 1,500 و 2,000 من العذارى.

بالنسبة للغذاء، يتم وضع حوالي 45 grams من خليط بنسبة 1 إلى 10 من الخميرة والسكر في القفص. ولجمع البيض، ضع طبقاً مملوءاً بالماء أسفل القفص؛ حيث ستقوم الإناث بوضع البيض عبر الشبكة، ليتجمع بعد ذلك في الماء.

نظراً لأن الإناث البكر يمكن أن تضع بويضات غير مخصبة، تأكد من أن جميع البويضات مخصبة من خلال الانتظار حتى يبلغ عمر الذباب أسبوعاً واحداً على الأقل قبل جمع البويضات. لجمع البويضات، قم بتصفية الماء باستخدام مصفاة دقيقة. ثم باستخدام ماصة باستور، انقل البويضات إلى صندوق بلاستيكي يحتوي على حوالي 0.5 liters من غذاء اليرقات القياسي.

إذا لم يتم وضع عدد كافٍ من البيض، فقم بزيادة محتوى الخميرة في غذاء الحشرة البالغة ليصل إلى 25%. ضع كل صندوق في حاوية شفافة تحتوي على طبقة من النخالة لتحفيز التعذر. غطِ الحاوورة بغطاء شبكي للسماح بتدوير الهواء. بعد حوالي 10 أيام، ابحث عن يرقات الطور الثالث التي قفزت إلى طبقة النخالة من أجل التعذر.

بمجرد العثور عليها، استعد لفحص وجود العذارى في الأيام التالية. ولجمع العذارى، استخدم فرشاة ناعمة لمسحها من الحاوية. في البداية، اجمع العذارى في كوب صغير.

بعد الانتهاء من عمليات الجمع، انقل الخادرات إلى قفص بالغين جديد. ومن المتوقع أن تخرج الحشرات البالغة في غضون 10 أيام تقريبًا. وبالنسبة لعملية الحقن المجهري، قم بتجهيز الشرائح مسبقًا.

قم بتثبيت شريط بطول ٢ سم من الشريط اللاصق مزدوج التغليف على شريحة، وحدد الحواف باستخدام قلم صيني لإنشاء جدار لطبقة زيتية تحافظ على رطوبة الأجنة. ولجمع الأجنة الموضعة حديثاً، اترك الإناث المخصبات الشابة تضع البيض لمدة ٣٠ دقيقة في صينية جديدة ثم اجمع الأجنة. ولإزالة الغشاء الجنيني (الكوريون) من الأجنة، اغمس المصفاة والبيض في محلول مبيض تجاري بتركيز 50% لمدة خمس ثوانٍ.

من الضروري عدم المبالغة في تبييض الأجنة. اغسل الأجنة المبيّضة فوراً عن طريق غمس المصفاة بعناية في ماء فائق النقاء ونظيف. كرر هذه العملية أربع مرات على الأقل.

بعد ذلك، احتفظ بالمصفاة في ماء فائق النقاء ونقِّح الأجنة في غضون ساعتين. تالياً، استخدم فرشاة رسم دقيقة لجمع حوالي 50 جنيناً ووضعها على قرص من ورق الترشيح الأسود المبلل بالماء. وتحت مجهر ستيريو تشريحي، رتب الأجنة في صفوف على الشريط مزدوج الطبقات لشريحة مجهرية مُجهزة.

قم بتوجيه جميع الأجنّة في الاتجاه نفسه. من المهم التعامل مع الأجنّة بحذر لأن ثقب غشاء الجنين باستخدام فرشاة الرسم قد يتسبب في ضرر يقلل من فرص بقاء الجنين على قيد الحياة. الآن، قم بتغطية الأجنّة بطبقة من زيت chloro-trifloro etholene.

يجب أن يظل الزيت محصوراً ضمن الحدود المرسومة بعلامة الصين. تجنب تجاوز هذه الحدود. باستخدام ماصة دقيقة، قم بتعبئة إبرة الحقن ببضع ميكرولترات من محلول الحمض النووي بتركيز يتراوح بين 1 إلى 2 µg/µL.

بعد ذلك، قم بتوصيل الإبرة بجهاز الحقن المجهري وضبطه لإجراء حقن لمدة نصف ثانية عند 800 hecto-pascals مع ضغط خلفي قدره 150 hecto-pascals. ولإجراء الحقن، استخدم مفتاح تشغيل بدواسة قدم، واستخدم الميكرومانيبوليتور للتحكم في الإبرة مع استخدام ضوابط المنصة لتحريك الشريحة. تأكد من خروج كتلة الحقن بشكل صحيح، ثم قم بمحاذاة الإبرة مع القطب الخلفي للجنين الأول في الصف.

عن طريق تحريك المنصة، أدخل الإبرة في الجنين واحُق كتلة الأحماض النووية. سيؤدي السائل المحقون إلى زيادة الضغط الداخلي مما ينتج عنه حركة طفيفة للجنين. حرر الدواسة، ثم قم بإزالة الإبرة من الجنين فوراً وببطء.

سوف يتسرب القليل من السيتوبلازم عند موقع الحقن، وهذا أمر طبيعي. وفي حال انفجار الأجنة أثناء الحقن، فاترك الأجنة تجف لبضع دقائق قبل تغطيتها بالزيت.

بعد الحقن، انقل الشريحة إلى طبق بتري. ضع قرصاً من ورق الترشيح في غطاء الطبق. بلل ورق الترشيح بالماء وأغلق طبق بتري بغشاء البارافين.

قم بتحضين الغرفة عند 25 درجة Celsius. وبعد يومين من الحقن، افحص الشرائح عدة مرات على مدار اليوم للتحقق من وجود اليرقات التي فقست. ابحث عن اليرقات في الزيت، وباستخدام فرشاة رسم دقيقة، انقلها إلى طبق بتري يحتوي على غذاء يرقات يعتمد على الجزر.

ضع في كل طبق ما يصل إلى 200 من اليرقات. لا يمكن لليرقة البقاء على قيد الحياة في الزيت لفترة طويلة، لذا ابحث عنها بشكل متكرر. قم بتحضين اليرقات مع إغلاق الغطاء بشكل شبه كامل، وذلك لضمان استمرار تدفق الهواء إلى اليرقات.

افحص الأطباق يومياً، وبعد مرور أسبوع استعد لجمع اليرقات عن طريق وضع الأطباق في حاوية تحتوي على النخالة. اجمع العذارى وتوقع خروج الحشرات البالغة منها بعد فترة وجيزة. لاحقاً، قم بتخدير البالغين الذين فقسوا باستخدام ثاني أكسيد الكربون وافحصهم للتأكد من حدوث التحول.

عند إجراء عملية الفرز، قد تكون طريقة التحشيد حاسمة. يمكن تخدير ذباب الفاكهة البالغ باستخدام الثلج أو CO2، ولكن التعرض لفترات طويلة قد يقلل من فرص بقاء البعض على قيد الحياة. تحقق من وجود الفلورة الحمراء باستخدام مرشح عريض لـ DS red.

أو افحص وجود الفلورة الخضراء باستخدام مرشح EYFP. انقل الأفراد المحولة إلى قفص صغير مع بالغين من النوع البري من الجنس opposite لإنشاء سلالة متغايرة الزيجوت. في إحدى التجارب، استُخدم RNA مزدوج السلالة لإسكات تعبير جين inx5.

يبدو أن الخط الجرثومي البالغ في مجموعات التحكم غير المحقونة طبيعي كما هو متوقع، بينما أظهرت الأفراد المعالجة خصيتين ومبايض غير مكتملة النمو. وقد أكد القياس الكمي لوفرة نسخ inx5 في بطون أفراد من كلا الجنسين انخفاضاً ملحوظاً في تعبير الجين مقارنة بمجموعات التحكم. وفي تجربة ثانية، تم توليد سلالتين من الحيوانات المنوية المحددة باستخدام محفز beta-2 tubulin لتوجيه علامات فلورية مختلفة.

أظهرت الذكور المعدلة وراثياً نمط فلورية مميزاً في الجسم وفي الخصيتين. نقدم في هذا الفيديو بروتوكولاتنا المحسنة لتربية وحقن الأحماض النووية مجهرياً في أجنة ذبابة الفاكهة. وبمجرد إتقان هذه العملية، يمكن حقن ما يصل إلى 1,000 جنين خلال يوم عمل يمتد لثماني ساعات.

باتباع هذا الإجراء، يمكن تنفيذ عمليات أخرى لمعادن مثل thy-lino-crisp-er و cas-min-eta-geno-meta-tine لتطوير جيل جديد من سلالات ذبابة المتوسط.