تسليم الأحماض النووية من خلال حقن مكروي الأجنة في مكافحة الحشرات الحشرات الزراعية العالمية، آفة Ceratitis الرؤيسية

الهدف العام من هذا الإجراء هو توصيل الأحماض النووية إلى أجنة Ceratitis Capitata ، وهي آفة زراعية مهمة ، لتوسيع صندوق الأدوات لمكافحتها في النهاية. تساعد هذه الطريقة في تصحيح الجينات وظيفيا في الكائن الحي الثابت ، وكذلك توليد سلالات معدلة وراثيا. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يتم حقن كمية منخفضة جدا من الأحماض النووية لتحقيق التأثيرات المرجوة.

حافظ على جميع مراحل حياة مستعمرة الذبابة المتوسطة عند 25 درجة مئوية مع رطوبة 65٪ و 12 ساعة من فترة الضوء / الظلام مع مرحلة التصوير تبدأ في الساعة 8 صباحا. أدخل شريطا إسفنجيا من خلال فتحة صغيرة في قاعدة القفص لتزويد الذباب بالماء عن طريق العمل الشعري. تقوم بإنشاء قفص سعة ستة لترات ، وتحميل واحد بما بين 1 ، 500 و 2 ، 000 خادرة.

بالنسبة للطعام ، قم بتحميل القفص بحوالي 45 جراما من خليط من واحد إلى 10 من الخميرة والسكر. لجمع البيض ، ضع طبقا مملوءا بالماء أسفل القفص. ستودع الإناث البيض من خلال الشبكة ، والتي ستتجمع بعد ذلك في الماء.

بسبب الإناث البكر يمكن أن تفرض البويضات ، تأكد من تخصيب جميع البويضات عن طريق الانتظار حتى يبلغ عمر الذباب أسبوعا على الأقل ، قبل جمع البيض. لجمع البيض ، قم بتصفية الماء بمصفاة دقيقة. ثم باستخدام ماصة بسترية ، انقل البيض إلى صندوق بلاستيكي محمل بحوالي 0.5 لتر من طعام اليرقات القياسي.

إذا لم يتم وضع ما يكفي من البيض ، فقم بزيادة محتوى الخميرة في طعام البالغين بنسبة تصل إلى 25٪ ضع كل صندوق في وعاء شفاف يحتوي على طبقة من النخالة لصالح التشرنق قم بتغطية الحاوية بغطاء شبكي للسماح بتدوير الهواء. بعد حوالي 10 أيام ، تحقق من وجود يرقات من الطور الثالث التي قفزت إلى طبقة النخالة بحثا عن الشرنقانق.

بمجرد العثور عليها ، استعد للتحقق من وجود شرانق في الأيام التالية. لجمع الخادرة ، استخدم فرشاة ناعمة لإزالتها من الحاوية. في البداية ، اجمع الشرانق في كوب صغير.

بعد اكتمال المجموعات ، انقل الشرانق إلى قفص بالغ جديد. يجب أن يظهر البالغون في حوالي 10 أيام. بالنسبة للحقن المجهري ، أعد الشرائح مسبقا.

قم بإرفاق شريط بطول سنتيمترين من الشريط المطلي المزدوج بشريحة وقم بتمييز الحواف بعلامة صينية لعمل جدار لطبقة زيت تحافظ على رطوبة الأجنة. لجمع الأجنة الموضوعة حديثا ، اسمح للإناث الصغيرة المخصبة بالبويضات لمدة 30 دقيقة على صينية جديدة ثم جمع الأجنة. لإزالة المشيمة من الأجنة ، اغمس المصفاة والبيض في محلول مبيض تجاري بنسبة 50٪ لمدة خمس ثوان.

من الأهمية بمكان عدم الإفراط في تبييض الأجنة. اغسل الأجنة المبيضة على الفور عن طريق غمس المصفاة بعناية في ماء نظيف فائق النقاء. افعل ذلك أربع مرات على الأقل.

بعد ذلك ، احتفظ بالمصفاة في ماء نقي للغاية وحقن الأجنة في غضون ساعتين. بعد ذلك ، باستخدام فرشاة رسم دقيقة ، اجمع حوالي 50 جنينا وضعها على قرص من ورق الترشيح الأسود المنقوع بالماء. تحت مجهر استريو تشريح ، قم بتصفيف الأجنة على شريط مزدوج الطلاء لشريحة مجهر معدة.

قم بتوجيه جميع الأجنة في نفس الاتجاه. من المهم التلاعب بالأجنة بعناية لأن ثقب غشاء الجنين بفرشاة الطلاء قد يتسبب في تلف يقلل من بقاء الجنين. الآن قم بتغطية الأجنة بطبقة من زيت الكلورو تريفلورو إثولين.

يجب احتواء النفط بحدود علامة الصين. لا تفيض الحدود. باستخدام ماصة دقيقة، قم بتحميل إبرة الحقن ببضعة ميكرولترات من محلول الحمض النووي بمعدل ميكروغرام إلى ميكروغرام لكل ميكرولتر.

بعد ذلك ، قم بتوصيل الإبرة بجهاز الحقن الدقيق واضبطه لتوفير حقنة نصف ثانية عند 800 هيكتو باسكال مع ضغط خلفي يبلغ 150 هكتو باسكال. للحقن ، استخدم مشغل دواسة القدم واستخدم المعالج الدقيق للتحكم في الإبرة أثناء استخدام عناصر التحكم في المرحلة لتحريك الشريحة. تأكد من إخراج بلعة الحقن بشكل صحيح ثم قم بمحاذاة الإبرة مع القطب الخلفي للجنين الأول في الصف.

عن طريق تحريك المرحلة ، أدخل الإبرة في الجنين وحقن بلعة الأحماض النووية. سيؤدي السائل المحقون إلى زيادة الضغط الداخلي مما يؤدي إلى حركة طفيفة للجنين. حرر الدواسة ، وقم بإزالة الإبرة من الجنين على الفور ولكن برفق.

سوف يتسرب القليل من السيتوبلازم في موقع الحقن. هذا طبيعي. إذا كانت الأجنة تنفجر بالحقن ، اترك الأجنة تجف لبضع دقائق قبل تغطيتها بالزيت.

بعد الحقن ، انقل الشريحة إلى طبق بتري. ضع قرصا من ورق الترشيح في غطاء الطبق. انقع الفلتر بالماء وأغلق طبق بتري بغشاء البارافين.

احتضان الغرفة عند 25 درجة مئوية. بعد يومين من الحقن ، تحقق من الشرائح عدة مرات على مدار اليوم بحثا عن اليرقات المفرغة. ابحث عن اليرقات في الزيت وباستخدام فرشاة رسم ناعمة ، انقلها إلى طبق بتري مع طعام اليرقات القائم على الجزر.

قم بتحميل كل طبق بما يصل إلى 200 يرقة. لا يمكن لليرقة البقاء على قيد الحياة في الزيت لفترة طويلة ، لذا ابحث كثيرا. احتضان اليرقات مع إغلاق الغطاء في الغالب ، لذلك لا يزال هناك تدفق هواء إلى اليرقات.

تحقق من الأطباق يوميا وبعد أسبوع استعد لجمع اليرقة عن طريق وضع الأطباق في وعاء به نخالة. اجمع الشرانق وبعد فترة وجيزة توقع ظهورها. في وقت لاحق ، قم بتخدير البالغين الذين فقسوا باستخدام ثاني أكسيد الكربون وفحصهم بحثا عن التحول.

عند الفحص ، يمكن أن تكون طريقة التعبئة هذه حاسمة. يمكن تخدير البالغين باستخدام الثلج أو ثاني أكسيد الكربون ، لكن التعرض المطول قد يقلل من بقاء الآخرين. تحقق من وجود مضان أحمر باستخدام مرشح عريض أحمر DS.

أو تحقق من وجود مضان أخضر باستخدام مرشح EYFP. انقل الأفراد المحولين إلى قفص صغير مع بالغين من النوع البري من الجنس الآخر لإنشاء سلالة متغايرة الزيجوت. في إحدى التجارب ، تم استخدام الحمض النووي الريبي مزدوج التوتر لإسكات التعبير الجيني inx5.

يبدو أن الخط الجرثومي البالغ للضوابط غير المحقونة طبيعي كما هو متوقع ، بينما أظهر الأفراد المعالجون خصيتين ومبيضين متخلفين. أكد القياس الكمي لوفرة نسخ inx5 في بطون الأفراد من كلا الجنسين التعبير المنخفض بشكل ملحوظ عن الجين مقارنة بالضوابط. في تجربة ثانية ، تم إنشاء سلالتين بحيوانات منوية مصنفة باستخدام محفز بيتا 2 توبولين لدفع علامات الفلورسنت المختلفة.

أظهر الذكور المعدلون وراثيا نمطا مضونا مميزا في الجسم وفي الخصيتين. من خلال هذا الفيديو ، نقدم بروتوكولاتنا المحسنة لتربية الأحماض النووية والحقن الدقيق في أجنة الذبابة المتوسطة. بمجرد إتقانها ، يمكن حقن ما يصل إلى 1000 جنين على مدار ثماني ساعات عمل في اليوم.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء معادن أخرى مثل thy-lino-crisp-er و cas-min-eta-geno-meta-tine لتطوير جيل جديد من سلالات الذبابة المتوسطة.