استخراج المواد الإنشائية خارج الخلية البوليمرية من هوائية حبيبي الحمأة

الهدف العام من التجربة التالية هو إظهار منهجية الاستخراج للحصول على مواد بوليمرية هيكلية خارج الخلية أو EPS ، من الرغوة الحيوية ، وتحديدا من الحمأة الحبيبية الهوائية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الحمأة الحبيبية. مثل فهم عملية التحبيب وتحليل تركيبة EPS.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن اختبار وجود بوليمرات الجلموف في EPS في وقت قصير. الطرد المركزي الحمأة الحبيبية عند 4 ، 000 مرة G وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة ، وصب المادة الطافية. اجمع الحبيبات في الحبيبات للاستخراج.

سخن 150 مل من ماء الصنبور في دورق زجاجي سعة 1000 مل على محرك مغناطيسي إلى 80 درجة مئوية. انقل ثلاثة جرامات من الحبيبات في قارورة محيرة سعة 250 مليلتر واملأ القارورة إلى 50 مل بالماء منزوع المعادن. أضف 0.67 جرام من ديكاهيدرات كربونات الصوديوم في القارورة للحصول على وزن 0.5٪ لكل حجم تركيز كربونات الصوديوم.

ضع القارورة التي تحتوي على الخليط في الحمام المائي. قم بتغطية القارورة وزجاج الدورق بشكل منفصل بورق الألمنيوم لمنع التبخر. قلب الخليط لمدة 35 دقيقة عند 400 دورة في الدقيقة و 80 درجة مئوية.

انقل الخليط إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. الطرد المركزي الأنبوب الذي يحتوي على الخليط عند 4 ، 000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. اجمع المادة الطافية وتخلص من الحبيبات.

خطوة غسيل الكلى اختيارية للحصول على EPS هيكلي من الحمأة الحبيبية الهوائية. لكن لها العديد من المزايا الموضحة في البروتوكول. ضع المادة الطافية في كيس غسيل الكلى ، مع قطع الوزن الجزيئي ل 3،500 دالتون ، وغسيل الكلى لمدة 24 ساعة مقابل 1000 مل من الماء فائق النقاء.

تغيير ماء غسيل الكلى بعد 12 ساعة لتعزيز تأثير غسيل الكلى. انقل المستخلص المخلل إلى دورق زجاجي سعة 250 مل وحرك الاستخراج ببطء عند 100 دورة في الدقيقة ودرجة حرارة الغرفة. راقب باستمرار تغيرات الأس الهيدروجيني باستخدام قطب PH ، مع إضافة 1 حمض هيدروكلوريك مولار إلى PH نهائي 2.2 05 للحصول على البيرة في الشكل الحمضي.

بعد ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 2.2 ، انقل المستخلص إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ، وجهاز طرد مركزي عند 4000 مرة جم وأربع درجات مئوية ، لمدة عشرين دقيقة. تخلص من المادة الطافية واجمع الحبيبات الشبيهة بالهلام. الحبيبات الشبيهة بالهلام هي بيرة في شكل حمضي.

للحصول على شكل الصوديوم من البيرة ، أضف ببطء 0.5 مولار من هيدروكسيد الصوديوم إلى الجل ، مع خلط الجل ببطء باستخدام عصا زجاجية باليد حتى يتم الوصول إلى درجة الحموضة 8.5. باستخدام ماصة باستور، قم بتقطير مستخلص بيرة الصوديوم ببطء في محلول كلوريد الكالسيوم. إذا كان EPS المستخرج له خصائص تشكيل هلام الهيدروجيل الأيوني ، تشكيل حبات سبيرالية على شكل قطرة.

بدلا من ذلك ، إذا لم يكن ل EPS المستخرج خصائص تشكيل هلام الهيدروجيل الأيوني ، فسوف يتشتت المستخلص في محلول كلوريد الكالسيوم. احتفظ بحبات الهيدروجيل ومحلول كلوريد الكالسيوم لمدة 30 دقيقة. استخدم ملعقة لإخراج حبات الهيدروجيل من محلول كلوريد الكالسيوم ونقلها إلى محلول EDTA.

قم بتخزين حبات الهيدروجيل في 10 مل من محلول EDTA لمدة ثلاث ساعات عند أربع درجات مئوية. يوضح هذا الاختبار مثالا واحدا على اختبارات الثبات الموضحة في البروتوكول. راقب ما إذا كان هناك تفكك مرئي للخرز أثناء هذا التخزين لتقييم ما إذا كانت الخرزات قادرة على تحمل هذه الظروف.

إذا كان الاستخراج ناجحا ، إذابة الحمأة الحبيبية الهوائية بعد خطوة الاستخراج القلوي ، وسيتم الحصول على حبيبات بعد تحمض الطرد المركزي ل EPS المستخرج. إذا كانت EPS المستخرجة عبارة عن EPS هيكلي ولديها القدرة على تكوين الهلاميات المائية بأيونات الكالسيوم ، تشكيل حبات الهلام عند تقطير EPS المستخرج في محلول الكالسيوم. إذا تم استخراج EPS التي لا تتمتع بقدرة تكوين الهلام هذه ، فسوف يتشتت محلول EPS في محلول الكالسيوم.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن تكون قادرا على إجراء استخراج EPS الهيكلي من الحمأة الحبيبية الهوائية. أيضا ، يجب أن تكون قادرا على اختبار قدرة تشكيل الهلام ل EPS التي تم الحصول عليها باستخدام أيونات الكالسيوم. اخترنا إظهار منهجية الاستخراج هذه لتوضيح تأثير تقنية الاستخراج على EPS التي تم الحصول عليها من الحمأة الحبيبية الهوائية.

إلى جانب ذلك ، أردنا أن نظهر أنه لا توجد تقنية استخراج EPS قابلة للتطبيق عالميا.