استخراج المواد الإنشائية خارج الخلية البوليمرية من هوائية حبيبي الحمأة

الهدف العام من التجربة التالية هو توضيح منهجية استخلاص للحصول على المواد البوليمرية خارج الخلوية الهيكلية أو EPS، من الرغاوي الحيوية، وتحديداً من الحمأة الحبيبية الهوائية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال الحمأة الحبيبية، مثل فهم عملية التحبيب وتحليل تركيب الـ EPS.

تكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية اختبار وجود البوليمرات الرغوية الهلامية في المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS) خلال وقت قصير. يتم تدوير الحمأة الحبيبية باستخدام جهاز الطرد المركزي عند 4,000 ×g ودرجة حرارة 4 °C لمدة 20 دقيقة، ثم يتم سكب السائل الطافي. تُجمع الحبيبات الموجودة في الراسب لغرض الاستخلاص.

قم بتسخين 150 milliliters من ماء الصنبور مسبقاً في دورق زجاجي سعة 1,000 milliliter باستخدام محرك مغناطيسي حتى 80 °C. انقل ثلاثة grams من الحبيبات إلى دورق مخروقي مزود بحواجز سعة 250 milliliter، ثم املأ الدورق حتى 50 milliliters باستخدام ماء منزوع المعادن. أضف 0.67 grams من عشاري هيدرات كربونات الصوديوم إلى الدورق للحصول على تركيز كربونات الصوديوم بنسبة 0.5% وزن/حجم.

ضع الدورق الذي يحتوي على الخليط في الحمام المائي. غطِّ الدورق والكأس الزجاجي بشكل منفصل بورق الألومنيوم لمنع التبخر. قلّب الخليط لمدة 35 دقيقة بسرعة 400 RPM ودرجة حرارة 80 درجة مئوية.

انقل الخليط إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 milliliter. قم بإجراء عملية الطرد المركزي للأنبوب الذي يحتوي على الخليط عند 4,000 ×g وبدرجة حرارة أربع درجات Celsius لمدة 20 دقيقة. اجمع السائل الطافي وتخلص من الراسب.

تُعد خطوة الديلزة اختيارية للحصول على المواد البوليمرية خارج الخلوية (EPS) الهيكلية من الحمأة الحبيبية الهوائية. ومع ذلك، فإن لها عدة مزايا موصوفة في البروتوكول. يتم نقل السائل الطافي باستخدام الماصة إلى كيس ديلزة، بحد قطع للوزن الجزيئي يبلغ 3,500 دالتون، وتجرى الديلزة لمدة 24 ساعة مقابل 1000ml من الماء شديد النقاوة.

قم بتغيير ماء الديلزة بعد 12 ساعة لتعزيز فاعلية عملية الديلزة. انقل المستخلص الذي تمت ديلزته إلى دورق زجاجي سعة 250ml وحرّك المستخلص ببطء بسرعة 100 rpm وفي درجة حرارة الغرفة. راقب باستمرار التغيرات في PH باستخدام قطب PH، مع إضافة حمض الهيدروكلوريك بتركيز 1 molar وصولاً إلى PH نهائي قدره 2.2 05 للحصول على ale في الشكل الحمضي.

بعد ضبط قيمة الـ pH لتصبح 2.2، انقل المستخلص إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50ml، ثم قم بإجراء الطرد المركزي عند 4000 ×g ودرجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة عشرين دقيقة. تخلص من السائل الطافي واجمع الراسب الهلامي. هذا الراسب الهلامي هو ale في صورته الحمضية.

للحصول على الصيغة الصوديمية من الطحالب، أضف هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 0.5 molar ببطء إلى الهلام، مع خلط الهلام ببطء يدويًا باستخدام ساق زجاجية حتى الوصول إلى PH 8.5. وباستخدام ماصة باستور، قم بتنقيط مستخلص الطحالب الصوديوم ببطء في محلول كلوريد الكالسيوم. وإذا كان لـ EPS المستخلص خصائص تكوين هلام هيدروجيل أيوني، فستتشكل حبيبات كروية على شكل قطرات.

وبدلاً من ذلك، إذا كانت المادة البوليمرية خارج الخلية (EPS) المستخلصة لا تمتلك خصائص تكوين هيدروجيل أيوني، فإن المستخلص سيتشتت في محلول كلوريد الكالسيوم. تُترك حبيبات الهيدروجيل في محلول كلوريد الكالسيوم لمدة 30 دقيقة. استخدم ملعقة لإخراج حبيبات الهيدروجيل من محلول كلوريد الكالسيوم ونقلها إلى محلول EDTA.

يتم تخزين حبيبات الهيدروجيل في 10ml من محلول EDTA لمدة ثلاث ساعات عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. يمثل هذا الاختبار مثالاً واحداً على اختبارات الاستقرار الموضحة في البروتوكول. راقب ما إذا كان هناك تحلل مرئي للحبيبات أثناء هذا التخزين لتقييم مدى قدرة الحبيبات على تحمل هذه الظروف.

إذا كانت عملية الاستخلاص ناجحة، فإن الحمأة الحبيبية الهوائية ستتحلل بعد خطوة الاستخلاص القلوي، وسيتم الحصول على راسب بعد تحميض وطرد مركزي لـ EPS المستخلص. وإذا كانت الـ EPS المستخلصة من النوع الهيكلي وتمتلك القدرة على تكوين هيدروجيل مع أيونات الكالسيوم، فستتكون حبيبات هلامية عند تقطير الـ EPS المستخلصة في محلول الكالسيوم. أما إذا تم استخلاص EPS لا تمتلك هذه القدرة على تكوين الهلام، فإن محلول EPS سيتشتت في محلول الكالسيوم.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون قادراً على إجراء استخلاص المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS) الهيكلية من الحمأة الحبيبية الهوائية. كما يجب أن تكون قادراً على اختبار قدرة الـ EPS المستخلصة على تكوين الهلام باستخدام أيونات الكالسيوم. لقد اخترنا عرض منهجية الاستخلاص هذه لتوضيح تأثير تقنية الاستخلاص على الـ EPS التي يتم الحصول عليها من الحمأة الحبيبية الهوائية.

علاوة على ذلك، أردنا إثبات أنه لا توجد تقنية استخلاص EPS قابلة للتطبيق بشكل عام.