إنتاجية عالية، تعدد والمستهدفة [بروتيوميك CSF الفحص لقياس المؤشرات الحيوية الاعصاب وئي E الإسوية الحالة

الهدف العام من هذه الطريقة هو التقدير الكمي السريع ومنخفض التكلفة لمؤشرات حيوية متعددة في السائل الدماغي النخاعي (CSF)، لتقييم مدى فائدتها في التشخيص ومراقبة العلاج. هذا مقايسة جديدة تتيح لنا قياس مؤشرات حيوية لم يكن من الممكن قياسها من قبل. ونعتقد أنه يمكن استخدام ذلك لأغراض تشخيصية وأيضاً للتمييز بين الأمراض التنكسية العصبية المختلفة، وربما لتقديم معلومات إنذارية أيضاً.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها مصممة لتكون سريعة، وبسيطة في تحضير العينات، وعالية التخصص، وفعالة من حيث التكلفة للنقل إلى المختبر السريري. وتمتد تطبيقات هذه التقنية لتشمل العلاج أو التشخيص، حيث يمكن استخدام هذا الاختبار عالي الإنتاجية في التجارب السريرية المستقبلية للعلاجات المبتكرة للتنكس العصبي. كما يمكن تطبيق هذه المنهجية على أمراض وأنسجة أخرى، مثل البول لاضطرابات الكلى، والبلازما لاعتلال عضلة القلب، والخلايا لتقييم تعدد القدرات.

لبدء هذا الإجراء، قم بإعادة تعليق الببتيدات الاصطناعية المطلوبة بتركيز مخزون يبلغ 1 mg/mL، وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. قم بإعداد تخفيفات بنسبة 1:10 من الببتيد من التركيز المخزون، واجمع 1,000 pmol من كل ببتيد في أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض الارتباط. قم بتجفيف عينة الببتيد المجمعة في جهاز تركيز SpeedVac.

عند الانتهاء، تُحفظ العينة عند -20 °C. بعد ذلك، يتم توزيع 100 µL من CSF في أنابيب طرد مركزي دقيقة منخفضة الارتباط. يتم تجفيف عينات CSF بالتجميد.

قم بإعادة تعليق جزء من عينة الببتيد المجمعة في محلول التخضير (digestion buffer) للحصول على تركيزات 10 و 1 picomole per microliter. الآن، قم بإضافة عينة الببتيد المجمعة إلى أجزاء مجمدة ومجففة من السائل الدماغي النخاعي (CSF) بحجم 100 microliter، بتركيزات 0، و 1، و 2، و 5، و 10، و 15 picomolar. بعد ذلك، أضف 20 nanograms من بروتين سليم غير مرتبط ليعمل كمعيار داخلي وضابط لكفاءة هضم التريپسين (trypsin).

أضف محلول الهضم المنظم إلى حصص السائل الدماغي الشوكي (CSF) حتى يصل الحجم النهائي إلى 20 microliters، ثم قم برج العينات بجهاز vortex. بعد ذلك، قم بهضم العينات وفقاً للبروتوكول القياسي عن طريق إضافة 1.5 microliters من dithiothreitol، والرج في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. عقب ذلك، أضف ثلاثة microliters من iodoacetamide إلى العينات ورجها في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة في الظلام.

بعد ذلك، أضف 165 µL من الماء المقطر مرتين. أضف 10 µL من محلول trypsin معدل بدرجة نقاء مخصصة للتسلسل وبتركيز 0.1 µg/µL، والمعاد تعليقه في محلول ammonium bicarbonate المنظم بتركيز 50 mM إلى العينات. تُحضن العينات في حمام مائي عند 37 °C طوال الليل.

بعد ذلك، يتم إيقاف عملية الهضم عن طريق تجميد العينات. وبعد إذابة نواتج هضم CSF على الجليد، تُوضع في جهاز الطرد المركزي بسرعة 16,000 ×g لمدة 10 دقائق. وعند الانتهاء، يتم نقل 60 µL من كل ناتج هضم إلى أنبوب زجاجي داخلي سعة 300 µL.

باستخدام نظام LC-MS، مجهز بعمود C18 UPLC، قم بحقن أعلى تركيز من نقطة منحنى المعايرة القياسي باستخدام تدرج خطي للأسيتونيتريل بنسبة من 1% إلى 40% خلال 10 دقائق. بمجرد اكتمال التشغيل، افتح الكروماتوغرام الناتج في البرنامج، ودون وقت الاستبقاء وأقوى انتقالين من حيث الشدة لكل ببتيد. وبناءً على هذه المعلومات، قم بتحديث طريقة مراقبة التفاعلات المتعددة (MRM) التي تم إنشاؤها مسبقاً باستخدام قنوات مؤقتة لقياس الببتيدات.

للحفاظ على الحساسية، اجعل كل قناة تحتوي على عدد نقاط لكل قمة أكبر من ثماني نقاط، ووقت استبقاء (dwell time) أكبر من 0.01 ثانية لانتقال واحد على الأقل لكل ببتيد. قم بتضمين تأخيرات المذيب (solvent delays) في طريقة MRM من خلال اختيار تأخيرات المذيب في أحداث الطريقة (method events) ضمن ملف طريقة MS. من الضروري جداً مطابقة القمة الصحيحة بدقة في طرق HPLC قصيرة المدى.

يمكن القيام بذلك باستخدام الببتيدات المضافة إلى المصفوفة والتي تُستخدم لمنحنى قياسي، ومراقبة الانتقالات المتعددة أثناء تطوير الطريقة. وأخيراً، قم بمراجعة تعليقات البيانات يدوياً لضمان الدقة. قم بتحليل كل ببتيد ونسبته إلى معيار داخلي مناسب مُسمى بنظير مستقر.

يظهر هنا مخطط كروماتوغرافي لعلامات ببتيدية هامة من مقايسة السائل الدماغي الشوكي (CSF) ذات الإنتاجية العالية. توفر البيانات نسباً معيارية بالنسبة للمعيار الداخلي ذي النظائر المستقرة ذي الصلة، والتي يمكن استخدامها لتحديد التركيزات المطلقة في السائل الدماغي الشوكي وتحليل التغيرات في العينات السريرية إحصائياً. وقد كشف التقدير الكمي لـ 74 ببتيداً مدرجاً في مقايسة السائل الدماغي الشوكي هذه أن 25 منها قد تغيرت بشكل ملحوظ في السائل الدماغي الشوكي لمرضى الخرف، وتُعرض هنا نتائج علامات الخرف pro-orexin وYKL chitinase-3-like protein.

يُعد ApoE4 عامل خطر معروفاً لمرض الزهايمر، ويعتمد الكشف عن الأشكال الإسوية لـ ApoE على الكشف عن الببتيدات المقابلة للتغيرات في الأحماض الأمينية للأشكال الإسوية E2 وE4. يظهر هنا نمط القمم المتوقع لكل مجموعة من الأشكال الإسوية. وبمجرد إعداد الطريقة، يمكن إتمام المقايسة في يوم واحد إذا نُفذت بشكل صحيح. وبعد تطوير هذه الطريقة، أصبح من الممكن قياس مجموعة جديدة من المؤشرات الحيوية بحساسية ونوعية تحليلية عالية، مما سيمكن الباحثين من تقييم الأمراض التنكسية العصبية بطريقة جديدة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية تصميم وتحسين مقايسة MRM من حيث الحساسية والخصوصية. لا تنسَ أن العمل مع DTE، والنمل الأبيض، وحمض الفورميك، والأنسجة البشرية يمكن أن يكون خطيراً للغاية، ويجب اتخاذ الاحتياطات، مثل ارتداء القفازات، أثناء هذا الإجراء.