إنتاجية عالية، تعدد والمستهدفة [بروتيوميك CSF الفحص لقياس المؤشرات الحيوية الاعصاب وئي E الإسوية الحالة

الهدف العام من هذه الطريقة هو تحديد المؤشرات الحيوية المتعددة في السائل الدماغي النخاعي بسرعة وبتكلفة معقولة لتقييم استخدامها في التشخيص ومراقبة العلاج. هذا اختبار جديد يسمح لنا بقياس المؤشرات الحيوية التي لم يكن من الممكن قياسها من قبل. ونعتقد أنه يمكن استخدام هذا لأغراض التشخيص وأيضا للتمييز بين الأمراض التنكسية العصبية المختلفة وربما أيضا إعطاء معلومات تنبؤية.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها مصممة لتكون سريعة وبسيطة في تحضير العينة ومحددة للغاية وفعالة من حيث التكلفة للترجمة إلى المختبر السريري. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو العلاج أو التشخيص ، حيث يمكن استخدام هذا الاختبار عالي الإنتاجية في التجارب السريرية المستقبلية للعلاجات الجديدة في التنكس العصبي. يمكن أيضا تطبيق هذه المنهجية على أمراض وأنسجة أخرى ، مثل البول لاضطرابات الكلى ، والبلازما لاعتلال عضلة القلب ، وخلايا تعدد القدرات.

لبدء هذا الإجراء ، قم بتعليق الببتيدات الاصطناعية المرغوبة إلى تركيز مخزون واحد ملليغرام لكل مليلتر ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بإعداد واحد من كل 10 تخفيفات للببتيد من تركيز المخزون ، وقم بتجميع 1 ، 000 بيكومول من كل ببتيد في أنبوب طرد مركزي دقيق منخفض الارتباط. جفف عينة الببتيد المجمعة في مكثف SpeedVac.

عند الانتهاء ، قم بتخزين العينة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. بعد ذلك ، قم بنقل 100 ميكرولتر من السائل الدماغي النخاعي في أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة منخفضة الارتباط. تجفيف عينات السائل الدماغي النخاعي بالتجميد.

أعد تعليق حصة من عينة الببتيد المجمعة في المخزن المؤقت للهضم للحصول على تركيزات 10 وبيكومول واحد لكل ميكرولتر. الآن ، قم برفع عينة الببتيد المجمعة في حصصات 100 ميكرولتر المجففة بالتجميد من السائل الدماغي النخاعي ، عند صفر ، واحد ، اثنين ، خمسة ، 10 ، و 15 تركيزات بيكومولر. بعد ذلك ، أضف 20 نانوغراما من البروتين السليم غير ذي الصلة ليكون بمثابة معيار داخلي والتحكم في كفاءة هضم التربسين.

أضف المخزن المؤقت للهضم إلى نقابات السائل الدماغي النخاعي إلى حجم نهائي يبلغ 20 ميكرولترا ، وقم بتدوير العينات. بعد ذلك ، قم باستيعاب العينات وفقا للبروتوكول القياسي عن طريق إضافة 1.5 ميكرولتر من dithiothreitol ، ورجها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، أضف ثلاثة ميكرولترات من اليودوأسيتاميد إلى العينات ورجه في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة في الظلام.

ثم أضف 165 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج. أضف 10 ميكرولتر من محلول التربسين المعدل بدرجة التسلسل 0.1 ميكروغرام لكل ميكرولتر ، معلق في محلول بيكربونات الأمونيوم 50 مليمولار إلى العينات. احتضان العينات في حمام مائي عند 37 درجة مئوية طوال الليل.

ثم أوقف عملية الهضم عن طريق تجميد العينات. بعد إذابة الجليد من هضم السائل الدماغي النخاعي على الجليد ، جهاز الطرد المركزي عند 16 ، 000 مرة جم لمدة 10 دقائق. عند الانتهاء ، انقل 60 ميكرولترا من كل هضم إلى زجاج سعة 300 ميكرولتر حقير.

باستخدام نظام LC-MS ، المجهز بعمود C18 UPLC ، قم بحقن أعلى تركيز من نقطة المنحنى القياسية باستخدام تدرج خطي أسيتونيتريل مدته 10 دقائق ، من واحد إلى 40٪. بمجرد اكتمال التشغيل ، افتح الكروماتوجرام الناتج في البرنامج ، ولاحظ وقت الاستبقاء وأهم انتقالين مكثفين لكل ببتيد. بناء على هذه المعلومات ، قم بتحديث مراقبة التفاعل المتعدد التي تم إنشاؤها مسبقا ، أو طريقة MRM بقنوات موقوتة لقياس الببتيدات.

للحفاظ على الحساسية ، احتفظ بكل قناة بنقاط لكل ذروة أكبر من ثمانية ووقت مكوث أكبر من 0.01 ثانية لانتقال واحد على الأقل لكل ببتيد. قم بتضمين تأخيرات المذيبات في طريقة MRM عن طريق تحديد تأخيرات المذيبات في أحداث الطريقة في ملف طريقة MS. من الأهمية بمكان مطابقة الذروة الصحيحة بشكل صحيح بطريقة HPLC قصيرة.

يمكن القيام بذلك باستخدام الببتيدات المسننة في المصفوفة المستخدمة لمنحنى قياسي ومراقبة التحولات المتعددة أثناء تطوير الطريقة. أخيرا ، راجع التعليق التوضيحي للبيانات يدويا لضمان الدقة. تحليل كل ببتيد ونسبة إلى معيار داخلي مستقر مناسب يسمى بنظائر مستقرة.

مخطط كروماتوغرام لعلامات الببتيد المهمة من مقايسة CSF عالية الإنتاجية. تعطي البيانات نسبا موحدة للمعيار الداخلي ذي الصلة المسمى بالنظائر المستقرة ، والتي يمكن استخدامها لتحديد تركيزات السائل الدماغي النخاعي المطلقة وتحليلها إحصائيا للتغيرات في العينات السريرية. كشف القياس الكمي ل 74 ببتيدا مدرجة في مقايسة السائل الدماغي النخاعي هذا أن 25 تم تغييرها بشكل كبير في السائل الدماغي النخاعي لمرضى الخرف ، ويتم عرض نتائج علامات الخرف pro-orexin و YKL chitinase-3-like protein here

ApoE4 هو عامل خطر معروف لمرض الزهايمر ، ويعتمد الكشف عن الأشكال الإسوية ApoE على الكشف عن الببتيدات المقابلة لتغيرات الأحماض الأمينية للأشكال الإسوية E2 و E4. يظهر هنا نمط الذروة المتوقع لكل مجموعة متساوية. بمجرد إعداد الطريقة ، يمكن إجراء الاختبار في يوم واحد إذا تم إجراؤه بشكل صحيح. بعد تطوير هذه الطريقة ، كان من الممكن قياس مجموعة جديدة من المؤشرات الحيوية ذات الحساسية التحليلية العالية والخصوصية ، وهذا سيمكن الباحثين من تقييم الأمراض التنكسية العصبية بطريقة جديدة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصميم وتحسين مقايسة MRM للحساسية والخصوصية. لا تنس أن العمل مع DTE والنمل الأبيض وحمض الفورميك والأنسجة البشرية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب تطبيق الاحتياطات ، مثل ارتداء القفازات ، أثناء هذا الإجراء.