الأجسام المضادة وصفها مع الأصباغ نيون عن طريق المغناطيسي البروتين والبروتين الخرز G

الهدف العام من هذه الطريقة هو وسم الأجسام المضادة بصبغات فلورية من عينات منقاة أو مباشرة من وسط زراعة الخلايا باستخدام حبيبات البروتين A أو G المغناطيسية. يمكن استخدام هذه الطريقة لتحسين كيمياء الوسم حتى للكميات الصغيرة من الأجسام المضادة الموجودة داخل وسط زراعة الخلايا، مما يؤدي إلى تطبيقات لاحقة أفضل لهذه الأجسام المضادة.

تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أن الأجسام المضادة لا تتطلب تنقية، وإمكانية استخدام كيمياء الأمين أو الثيول، كما يمكن تنفيذ الطريقة آلياً أو يدوياً. ابدأ بإعادة تعليق الحبيبات بشكل متجانس عن طريق الرج اللطيف. بعد ذلك، أضف 50 µL من الحبيبات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL.

بعد ذلك، ضع الأنبوب في حامل مغناطيسي. وبعد مرور 10 ثوانٍ، استبدل محاليل التخزين بعناية بـ 250 µL من محلول ربط الأجسام المضادة واملأ الخرزات جيداً. وبعد مرور 10 ثوانٍ أخرى، استبدل محلول الربط بعناية بـ 1 mL من الجسم المضاد المطلوب.

ثم اخلط العينة لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وفي نهاية فترة الحضانة، أعد الأنابيب إلى المغناطيس وقم بإزالة الراشح عندما تنتقل الحبيبات إلى جوانب الأنبوب. بعد ذلك، اشطف خليط الحبيبات والأجسام المضادة بغسلين لمدة 10 ثوانٍ لكل منهما، باستخدام 250 µL من محلول غسل ربط الأجسام المضادة في كل غسلة.

لوصم الأجسام المضادة باستخدام كيمياء الأمين، بعد الغسلة الثانية، استبدل محلول الغسيل بـ 100 µL من محلول ربط الأمين الموحد وأضف 2.5 µL من صبغة تفاعلية مع الأمين مُحضرة حديثاً لكل 100 µg من الجسم المضاد. قم برج العينة بجهاز vortext لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للحفاظ على الخرزات في حالة تعليق أثناء عملية الوصم. بعد ذلك، أعد الأنبوب إلى المغناطيس لمدة 10 ثوانٍ وقم بإزالة السائل العلوي.

اغسل الحبيبات مرتين باستخدام محلول غسيل ربط الأجسام المضادة، كما تم توضيحه للتو. بعد ذلك، استبدل محلول الغسيل بـ 50 µL من محلول الشطف واخلط الحبيبات لمدة خمس دقائق. أعد الأنبوب إلى المغناطيس لمدة 10 ثوانٍ وانقل الجسم المضاد الذي تم شطفه إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد يحتوي على 5 µL من محلول التعادل.

قم بشطف الأجسام المضادة مرة أخرى، كما تم توضيحه للتو، مع سحب العينات الشطفية. بعد ذلك، قم بقياس امتصاصية المتقارن من الجسم المضاد والصبغة عند 280 نانومتر وعند قيمة lambda max الخاصة بالصبغة. ولوصم الأجسام المضادة باستخدام كيمياء الثيول، استبدل محلول الشطف بعد الغسلة الثانية بـ 250 ميكرولتر من محلول الثيول الاقتراني، ثم اخلط الخرز عن طريق الماصة بلطف.

بعد مرور 10 ثوانٍ، اغسل الخرزات مرتين باستخدام محلول غسيل ربط الأجسام المضادة. بعد ذلك، استبدل محلول الغسيل بـ 100 µL من محلول ربط الثيول وأضف DTT ليصل التركيز النهائي إلى 2.5 mM. اخلط الخرزات لمدة 60 دقيقة أخرى.

بعد ذلك، أعد الخرزات إلى المغناطيس لمدة 10 ثوانٍ وتخلص من المحلول المنظم. ثم أضف 250 microliters من محلول ربط الثيول (thiol-conjugation buffer) إلى الخرزات مع الخلط برفق. وبعد مرور 10 ثوانٍ، اغسل الخرزات مرتين باستخدام محلول غسل ربط الأجسام المضادة (antibody-binding wash buffer)، واستبدل الغسلة الثانية بـ 100 microliters من محلول ربط الثيول الطازج.

الآن، أضف 2.5 µL من صبغة تفاعل الثيول المحضرة حديثاً لكل 100 µg من الأجسام المضادة، واخلط الحبيبات لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وفي نهاية فترة الحضانة، أعد الأنبوب إلى المغناطيس لمدة 10 ثوانٍ. ثم استبدل السائل الطافي بـ 250 µL من محلول منظم لربط الثيول حديث التحضير مع الخلط اللطيف.

بعد مرور 10 ثوانٍ، اغسل الحبيبات مرتين. بعد ذلك، استبدل محلول الغسيل بـ 50 µL من محلول الاستخلاص وقم باستخلاص الجسم المضاد المقترن مرتين، كما تم توضيحه للتو. ثم، قم بقياس امتصاصية الجسم المضاد المقترن بالصبغة عند 280 nm وعند lambda max للصبغة.

تؤدي الألفة القوية بين الأجسام المضادة وProtein G، والألفة المتينة للمغناطيس تجاه الخرزات، وتحسين الطريقة قبل تنقية الخرزات، مجتمعةً إلى فقدان ضئيل للأجسام المضادة أثناء تفاعل الوسم، وهو ما يتضح من خلال الاستعادة الفعالة لثلاثة أنماط مصلية مختلفة من الأجسام المضادة الفأرية بعد الوسم المزدوج الفلوري مقارنة بالتنقية البسيطة. وتظهر هذه الاستعادة أيضاً في هلامات Coomassie، حيث تؤدي خصائص الارتباط غير النوعي المنخفضة لخرزات Protein G المغناطيسية إلى وجود سلاسل ثقيلة وخفيفة عالية النقاء وموسومة بفلوروكروما مزدوجة. كما أن الوسم على الخرزات باستخدام خرزات Protein A المغناطيسية يتوافق أيضاً مع أصباغ فلورية متعددة، مما يؤدي إلى استعادة عالية ونسب جيدة من الصبغة إلى الجسم المضاد.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات إذا نُفذت بشكل صحيح، مما يسمح بالتعامل مع عينات متعددة يدويًا أو عبر منصة مؤتمتة لتحسين الإنتاجية. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الحفاظ على الحبيبات المغناطيسية في حالة تعليق طوال الوقت.

اختر الحجم المناسب من الخرزات المغناطيسية للعينة. وقم بتحسين كمية الصبغة الفلورية للأجسام المضادة المستهدفة. بعد اتباع هذا الإجراء، يجب اختبار الأجسام المضادة الموزومة لتحديد مدى فعاليتها باستخدام المقايسات البيولوجية ذات الصلة، مثل ELISA أو FACS أو المقايسات الخلوية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية وسم الأجسام المضادة المنقاة وغير المنقاة بعلامات فلورية أو جزيئات صغيرة أخرى، مثل البيوتين أو الأدوية السامة للخلايا، باستخدام حبيبات Protein A أو G المغناطيسية.