كشف اللونية من البكتيريا عن طريق محك الاختبار

الهدف العام من هذه التجربة هو استعراض اختبار ورقة عباد الشمس المعدل والبسيط للكشف عن البكتيريا. تصف هذه الطريقة كيفية ربط إنزيم DNA قادر على شطر RNA يتم تنشيطه بواسطة بكتيريا E.coli بمنصة نقل إشارات تعتمد على إنزيم اليورياز لإحداث تغيير في اللون استجابةً لبكتيريا E.coli. وتتمثل الميزتان الرئيسيتان لهذه التقنية في بساطة الاختبار وقابليته للتطبيق على إنزيمات DNA أخرى شاطرة لـ RNA تستجيب لمواد تحليلية مختلفة.

سيقوم كل من Seperh Manchehry وDingran Chang، وهما طالبان في مرحلة الدراسات العليا من مختبر الدكتور Yingfu Li في جامعة McMaster، بتوضيح الإجراء. بعد تحضير الكواشف والمحاليل المنظمة وفقاً للبروتوكول المكتوب، قم بتحضير محلول مركز من succinimidyl 4-cyclohexane-1-carboxylate، أو SMCC، عن طريق إذابة 1 mg من SMCC في 676 µL من DMSO. قم بالرج باستخدام جهاز Vortex وضع المحلول على الثلج حتى وقت الاستخدام.

أذب 1 mg من اليورياز (urease) في 1 mL من 1x PBS وضعه على الثلج حتى وقت الاستخدام. ولتخليق الحمض النووي لليورياز، أو UrDNA، أضف 10 µL من LD1 بتركيز 100 µM إلى أنبوب طرد مركزي سعة 2.5 mL. ثم أضف 140 µL من الماء المقطر مرتين و 40 µL من 10x PBS وقم بالرج باستخدام جهاز vortex.

بعد ذلك، أضف 80.5 µL من مخزون SMCC و159.5 µL من DMSO. ثم قم بالرج باستخدام جهاز vortext مرة أخرى واستخدم جهاز طرد مركزي مكتبي للدوران لفترة وجيزة. حضّن التفاعل عند 37 °C في حاضنة أو كتلة تسخين لمدة 60 دقيقة.

بعد انتهاء فترة الحضن، أضف 200 µL من 1x PBS، و 60 µL من أسيتات الصوديوم بتركيز 3 M، و 1.5 mL من الإيثانول البارد بتركيز 100% إلى الأنبوب. اخلط المكونات باستخدام جهاز الفورتكس (vortexing)، ثم حضّن التفاعل عند درجة حرارة -20 °C لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، قم بطرد المحلول مركزياً بسرعة 20,000 ×g ودرجة حرارة 4 °C لمدة 20 دقيقة.

بعد ذلك، قم بإزالة السائل الطافي وتجفيف الراسب تحت vacuum. أضف 400 µL من مخزون urease إلى الراسب المجفف واحضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 ساعات. انقل 200 µL من المرافق الخام إلى عمود ترشيح طرد مركزي بحد قطع للوزن الجزيئي يبلغ 100,000 دالتون تم غسله مسبقاً.

قم بطرد العمود مركزياً عند 14,000 ×g لمدة خمس دقائق. انقل الـ 200 µL المتبقية من المتقارن الخام إلى العمود وقم بطرده مركزياً عند 14,000 ×g لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، قم بإزالة العمود ووضعه مقلوباً في أنبوب تجميع جديد مخصص لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 2 mL.

قم بطرد العمود المقلوب والأنبوب مركزياً عند 1,000 ×g لمدة دقيقتين. بعد إزالة أنبوب الجمع، أضف 30 µL من محلول 1x PBS إلى عمود الطرد المركزي لغسل الغشاء من أجل استعادة إضافية للمترافقات. اقلب العمود مرة أخرى وضعه مجدداً في أنبوب الجمع.

قم بطرد column في جهاز الطرد المركزي عند 1,000 ×g لمدة دقيقتين. قم بإزالة column والتخلص منها. يتم تخزين UrDNA عند درجة حرارة أربع درجات مئوية حتى وقت الاستخدام.

لتجميع DNAzyme قاطع للـ RNA يتم تنشيطه بواسطة بكتيريا E.coli، أو EC1، وUrDNA على حبيبات مغناطيسية، اخلط مخزون الحبيبات المغناطيسية جيداً وانقل 100 microliters من معلق الحبيبات إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter. بعد ذلك، ضع الأنبوب على حامل رف مغناطيسي لعزل الحبيبات. قم بإزالة السائل الطافي باستخدام الماصة وأضف 150 microliters من محلول الربط المنظم، أو BB، إلى الأنبوب.

أخرج الأنبوب من الحامل ونقّر عليه بعناية لإعادة تعليق الخرزات في محلول متجانس. بعد تكرار غسيل BB مرتين إضافيتين مع إبقاء الخرزات معلقة في BB، أضف 10 µL من EC1 بتركيز 10 µM. اخلط المزيج بعناية عن طريق النقر على الأنبوب.

يتم تحضين المحلول مع الرج الخفيف لمدة 30 دقيقة. ولتجنب تكتل الحبيبات، يتم النقر على الأنبوب كل دقيقتين إلى ثلاث دقائق. بعد ذلك، يُعاد وضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق على الحامل المغناطيسي لعزل الحبيبات، ثم يتم إزالة السائل الطافي باستخدام الماصة.

بعد ذلك، استخدم 150 µL من BB لغسل الحبيبات ثلاث مرات. وبمجرد اكتمال عملية الغسيل، قم بتعليق الحبيبات في حجم إجمالي قدره 150 µL من BB. أضف إلى هذا المحلول 15 µL من UrDNA وسخن العينة عند 45 °C لمدة دقيقتين، ثم برد المحلول إلى درجة حرارة الغرفة واتركه في الحاضنة لمدة ساعتين. أعد أنبوب الطرد المركزي الدقيق إلى الحامل المغناطيسي لعزل الحبيبات، ثم قم بإزالة السائل الطافي باستخدام الماصة.

أضف 100 µL من محلول التفاعل المنظم، أو RB، ثم أخرج الأنبوب من الحامل المغناطيسي وأعد تعليق الحبيبات بعناية. بعد تحضير خلايا E.coli وفقاً للبروتوكول المكتوب، قم بغسل مسبق لأنبوب طرد مركزي سعة 1.5 mL عن طريق إضافة 100 µL من RB والرج باستخدام جهاز الفورتيكس. بعد ذلك، تخلص من المحلول المنظم. أضف 15 µL من EC1 المجمّع إلى الأنبوب المغسول، ثم ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي واشفط السائل الطافي.

أخرج الأنبوب من الحامل، وأضف 100 µL من RB، ثم أعد تعليق الحبيبات المغناطيسية بعناية. بعد غسل الحبيبات باستخدام RB مرتين إضافيتين وإزالة RB، أضف 10 µL من عينة E.coli إلى الأنبوب واخلط المحتويات برفق عن طريق النقر على الأنبوب. بعد ذلك، قم بتحضين التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

بعد الانتهاء من الحضن، أضف 90 µL من الماء المقطر مرتين وضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي. وبعد مرور ثلاث دقائق تقريبًا من الفصل المغناطيسي، انقل بعناية 85 µL من السائل الطافي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 mL. ومن المهم جدًا سحب المحلول بدقة باستخدام الماصة لتجنب سحب أي من الخرزات المغناطيسية.

هذه الحبيبات محملة بإنزيم اليورياز وسوف تعطي إشارة إيجابية خاطئة. أضف 15 µL من Phenol red بتركيز 0.04% و 100 µL من محلول الركيزة. بعد ذلك، التقط صوراً في فواصل زمنية محددة لتسجيل التغير في اللون.

يجب أن يكون اللون الابتدائي لاختبار ورقة عباد الشمس أصفر، مما يشير إلى أن pH المحلول أقل من 5.5. وإذا لزم الأمر، يمكن تعديل pH الابتدائي لاختبار عباد الشمس باستخدام محلول منظم ضعيف، مثل محلول منظم من خلات الصوديوم بتركيز one millimolar عند pH five. يوضح هذا الشكل نتائج اختبار عباد الشمس البكتيري، حيث استُخدم DNAzyme EC1 القادر على شطر RNA والمُنشَّط بواسطة E.coli كـ DNAzyme، واستُخدم Phenol red كمؤشر للـ pH.

كما يتضح من عدم حدوث تغيير في اللون في غياب E.coli، فإن EC1 يتسم بخصوصية عالية ويظهر نشاطاً ضئيلاً تجاه البكتيريا الأخرى. وتعتمد درجة تغير اللون على كل من عدد خلايا E.coli المستخدمة في خطوة تفعيل الـ DNAzyme والوقت المخصص لخطوة تحلل اليوريا. حيث يؤدي استخدام عدد أكبر من خلايا E.coli إلى تغير لوني أقوى، كما أن إطالة وقت تحلل اليوريا تسمح بالكشف عن عدد أقل من الخلايا.

يوضح هذا الرسم البياني تغير pH كما تم رصده باستخدام مقياس pH محمول. أدى وجود 10⁷ من خلايا E.coli إلى زيادة تدريجية في pH بمقدار ثلاث وحدات خلال 10 دقائق. وفي المقابل، لم يؤدِّ غياب E.coli إلى حدوث تغيرات ملحوظة في pH تحت الظروف ذاتها.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إنجازها في غضون ساعتين إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر أن إنزيم اليورياز نشط للغاية، وأن الغسيل غير الكافي أو التلوث سيؤدي إلى نتيجة إيجابية كاذبة. وبعد اتباع هذا الإجراء، يمكن تطبيق هذه الطريقة لاختبار وجود بكتيريا E.coli في ظروف أكثر ملاءمة، مثل اختبار جودة المياه البيئية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية الاستفادة من اختبار ورقة عباد الشمس البسيط للكشف عن بكتيريا E.coli. تذكر أن هذا الاختبار يمكن استخدامه للكشف عن سلالات E.coli الممرضة، وهي خطيرة للغاية. يجب عليك تلقي تدريب على السلامة البيولوجية قبل إجراء أي من الاختبارات الخاصة بالبكتيريا الممرضة.