استخدام المستحثة الجسدية التحليل القطاعي (ISSA) لدراسة الجينات والمروجين المشاركة في تشكيل الخشب والتنمية الجذعية الثانوية

الهدف العام من تحليل القطاعات الجسدية المستحثة هو توفير تقنية ذات إنتاجية متوسطة إلى عالية للتوصيف الوظيفي لبنى الجينات والمحفزات في أنسجة الساق الثانوية للأشجار ضمن أطر زمنية قصيرة نسبياً. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة محورية حول مكان وزمان التعبير الجيني، فضلاً عن دورها في عمليات بيولوجية هامة مثل تكوين الخشب وتطور الساق الثانوية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في كونها إجراءً فعالاً وسهلاً وسريعاً نسبياً، وقابلاً للتطبيق على مجموعة واسعة من أنواع الأشجار.

للبدء، قم بتجهيز أنبوب نظيف سعة 50 milliliter بغطاء لولبي يحتوي على 19 milliliters من وسط LB طازج عند درجة حرارة 28 degree Celsius مع المضادات الحيوية المناسبة للاصطفاء البكتيري. أضف 1 milliliter من مزرعة A.tumefaciens وافحص الكثافة الضوئية، أو OD، عند 600 nanometres. إذا كانت قيمة OD أعلى من 0.1، قم بمزيد من التخفيف باستخدام وسط LB دافئ. ضع مزرعة A.tumefaciens في حاضنة هزازة حتى تصل قيمة OD 600 إلى ما بين 0.4 و0.6.

بمجرد تحقيق ذلك، يتم طرد الخلايا مركزياً لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C وقوة 1,000 x g. يتم سكب السائل من الأنبوب وإعادة تعليق الكتلة الخلوية فوراً باستخدام 1 mL من وسط MS المبرد. تُنقل المعلق إلى أنبوب دقيق نظيف سعة 2 mL ويُحفظ على الثلج حتى وقت الحاجة.

ابدأ التجربة خلال فصل الربيع أو أوائل الصيف، واختر نباتات ذات كامبيوم نشط وسريع النمو. ويمكن التأكد من ذلك إذا كان من السهل تقشير اللحاء عن الخشب. حدد مقطعاً مستقيماً من الساق بالقرب من قاعدة النبات وقم بإزالة أي أوراق أو أغصان.

باستخدام مشرط حاد، قم بعمل نافذة كامبيوم بمساحة سنتيمتر مربع واحد عن طريق إجراء شقين متوازيين بطول 20 مليمتر عبر اللحاء بمسافة 5 مليمتر بينهما، ثم إجراء قطع أفقي واحد ينصف القطعين الرأسيين عند الطرف القاعدي. قم بإزالة شريحة اللحاء للأعلى للكشف عن نسيج الخشب النامي. وبعد ذلك، وباستخدام ماصة، أضف كمية كافية من وسط التلقيح لترطيب سطح الخشب المكشوف تماماً.

أعد إدخال شريط اللحاء على الفور في الساق وثبته بإحكام باستخدام Parafilm. كرر خطوات التلقيح هذه لجميع الجينات أو المحفزات المستهدفة، مع إنشاء نوافذ كامبيوم جديدة على مسافة سنتيمتر واحد على الأقل فوق أو تحت النوافذ الموجودة وبإزاحة قدرها 90 درجة. بالإضافة إلى ذلك، قم بتلقيح النوافذ بنواقل التحكم الموجبة والسالبة على نفس الساق أو السيقان، كما هو الحال مع اللقاحات التجريبية.

راقب نمو الساق بشكل دوري، وبمجرد ملاحظة نمو قطري لا يقل عن خمسة مليمترات، قم بحصاد النسيج لإجراء اختبار beta-glucuronidase، أو اختبار GUS. ولقص المادة المختبرة، قم أولاً باستئصال النافذة الكامبيومية من الساق مع إزالة أي نسيج لا يشكل جزءاً من النمو الجديد. أما بالنسبة للدراسات المتعلقة بمورفولوجيا خلايا أو أنسجة الخشب واللحاء الناضجة، فقم بتقشير اللحاء عن الخشب.

بدلاً من ذلك، بالنسبة للأبحاث التي تتطلب بقاء منطقة الكامبيوم سليمة، أو لتقييم أنماط تعبير المحفز، يتم تقطيع النافذة الكامبيومية عرضياً باستخدام شفرة حلاقة لإنشاء أقراص يتراوح سمكها بين 0.5 و1 مليمتر. تُوضع أنسجة النافذة الكامبيومية التي تم جمعها في أنابيب فردية ذات قاع مستدير سعة 14 ملليلتر، وتُغسل مرتين في محلول منظم من الفوسفات بتركيز 0.1 مولار عند pH 7 لمدة خمس دقائق في كل مرة، مع ضمان غمر النسيج بالكامل. وفي نهاية الغسلة الثانية، يجب الحرص على إزالة كافة المحاليل الزائدة.

بعد ذلك، أضف 5 mL من كاشف GUS إلى كل أنبوب. إذا لم يغطِ الكاشف عينة النسيج بالكامل، أضف كمية إضافية من الكاشف. قم بحضن الأنابيب لمدة عشر دقائق عند 55 °C في الظلام.

بعد ذلك، يتم تحضين الأنابيب لمدة تتراوح بين 12 إلى 16 ساعة إضافية على جهاز هزاز عند 37 درجة مئوية في الظلام مع استخدام تحريك خفيف. وعند إخراجها من المحضنة، يتم أخذ مجموعة فرعية عشوائية من الأنابيب وفحص pH لكاشف GUS باستخدام ورق عباد الشمس بنطاق pH من صفر إلى سبعة. وإذا كان أي منها يتمتع بـ pH أقل من ستة، يتم تمييزها ثم فحص بقية الأنابيب.

قم بتسمية واستبعاد أي أنابيب ذات pH أقل من ستة. قم بسكب كاشف GUS من الأنابيب واستبداله بكمية كافية من الإيثانول بتركيز 70% لتغطية النسيج. احفظ العينات عند درجة حرارة أربع درجات Celsius حتى وقت الحاجة.

باستخدام زوج نظيف من الملاقط، قم بإزالة جميع أنسجة نافذة الكامبيوم من أنبوب العينة وضعها على صينية صغيرة أو طبق بتري للفحص المجهري. ضع العينة تحت عدسة مجهر تشريحي بتكبير يتراوح بين 1X و 4X، ثم حدد واحصِ عدد الخلايا أو الأنسجة التي تظهر صبغة زرقاء زاهية. وفي الحالات التي تمت فيها إزالة اللحاء، قم بعدّ عدد القطاعات في نسيج الكامبيوم الموجود على سطح الخشب النامي.

بالنسبة للعينات المقطعة إلى أقراص، قم بعدّ عدد القطاعات الموجودة في الأنواع المختلفة من الخلايا أو الأنسجة. تأكد من فحص كلا جانبي القرص، ومن مطابقة القطاعات التي تمتد عبر قرصين لضمان عدم المبالغة في تقدير الأعداد. ضع الأنسجة التي تحتوي على قطاعات فقط مرة أخرى في الأنبوب الذي يحتوي على ethanol بتركيز 70% واحفظها حتى وقت الحاجة إليها.

كرر التحليل لأي نوافذ كامبيوم إضافية تم حصادها، بما في ذلك الضوابط الموجبة والسالبة. وللمساعدة في التحديد الدقيق وتصنيف القطاعات، نقترح أن تطلع على تشريح الساق الثانوية ونموها، بما في ذلك استجابات الساق للإصابة. يوضح هذا الشكل العديد من عمليات التحول الناجحة التي تظهر هنا على شكل مناطق صبغ زرقاء.

تظهر نافذة من تقشير اللحاء كمثال عدة قطاعات وأقراص محولة تم حصادها من نوعين من الأشجار، حيث تبين هذه القطاعات عملية التحول والنمو الشعاعي اللاحق. كما يمكن ملاحظة التحول في مجموعة من أنواع الأنسجة؛ إذ يمكن هنا رؤية قطاعات الساق في البشرة الخارجية، واللحاء، والبرانشيميا الجراحية، وعدة مناطق نسيجية أخرى في الحور الأبيض.

تظهر هذه الصورة نتائج تعبير محفز الجينات في مشتقات الكامبيوم. في هذا المثال، نرى نسبة الصبغ في كل نوع من أنواع الأنسجة في تجربة شملت مجموعة من محفزات CesA من eucalyptus grandis التي تم نقلها إلى سيقان هجن الكالبتوس. يتم تمثيل التعبير في اللحاء والخشب النامي والخشب المكتمل كنسبة مئوية.

يمكن أيضاً حساب متوسط عدد أحداث التحول لكل سنتيمتر من الكامبيوم الملقح لكل محفز أو جين مستهدف. يوضح هذا الجدول البيانات الخاصة بالقطاعات النموذجية التي تم تحديدها في عينات من الكينا والحور التي تم تحويلها باستخدام ضابط إيجابي أو محفز مستهدف، والتي جرى تحليلها باستخدام طريقة حصاد الأقراص. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكنها أن توفر طريقة سريعة وفعالة وقابلة للتطبيق على نطاق واسع لتشريح الطبيعة المعقدة للتمايز الكامبيومي مع التكوين في تطور الساق الثانوية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية تحضير النباتات والبكتيريا، وكيفية إجراء التحول الوراثي، وزراعة السيقان وحصادها، بالإضافة إلى كيفية تحديد وتصنيف الأنسجة المعدلة وراثياً لتقييم النمط الظاهري.