ل

الهدف العام من هذه التجربة هو دراسة التبعات المترتبة على سلامة الخلايا البطانية ونفاذيتها عند التفاعل مع الخلايا التائية المنشطة. تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال المناعة العصبية، مثل كيف يؤثر التفاعل المباشر بين الخلايا التائية والخلايا البطانية على سلامة ونفاذية الحاجز الدموي الدماغي. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها تتيح تقييماً آلياً وفي الوقت الفعلي لوظيفة الحاجز عند التعديل المستهدف للتفاعل بين الخلايا التائية والخلايا البطانية.

تمتد تداعيات هذه التقنية نحو علاج اضطرابات الجهاز العصبي المركزي ذات المناعة الذاتية، لأنها توفر رؤية متعمقة حول تكسر الحاجز الدموي الدماغي بوساطة الخلايا T، وهي خطوة حاسمة في إمراضية مثل هذه الأمراض. تركز هذه الطريقة على خصائص الحاجز الدموي الدماغي البحري أثناء EAE، ولكن يمكن تطبيقها أيضاً على نماذج الحاجز الدموي الدماغي لدى الحمراء أو البشر، بالإضافة إلى دراسات اضطرابات الجهاز العصبي المركزي ذات المناعة الذاتية الأخرى.

بشكل عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة صعوبات بسبب التحديات المحتملة المتعلقة بالتوقيت الأمثل للدمج بين زراعة الخلايا البطانية الأولية وتنشيط الخلايا التائية. لقد قمنا بتطوير هذه الطريقة في البداية عندما شرعنا في استقصاء تأثيرات مستويات تنشيط الخلايا التائية المختلفة على خصائص الحاجز الدموي الدماغي أثناء التصلب المتعدد التجريبي ذاتي التحفيز (EAE)، وهو نموذج حيواني لمرض التصلب المتعدد. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث إن إعداد المزارع المشتركة للخلايا التائية والخلايا البطانية يصعب تعلمه، لأن الاختلافات الأولية في الخلايا التائية بين الآبار قد تؤدي إلى تمثيلات خاطئة للنتائج لاحقاً.

لبدء هذا الإجراء، في اليوم الخامس بعد عزل خلايا MBMEC، يتم طلاء الحشوات النفاذة مسبقاً بـ 80 µL من محلول طلاء MBMEC لكل حشوة. تُحضن الحشوات عند درجة حرارة 37 °C، و5% carbon dioxide، لمدة ثلاث ساعات. بعد إزالة محلول طلاء MBMEC من الحشوات، تُغسل خلايا MBMECs بإضافة 2 mL من محلول PBS بدرجة حرارة الغرفة إلى كل بئر، ثم يتم شفطه بعد دقيقة واحدة، وتُكرر هذه العملية مرة أخرى.

بعد ذلك، أضف 0.05%Trypsin EDTA بمقدار 300 microliters لكل بئر واتركه في الحاضنة لمدة تتراوح من خمس إلى عشر دقائق. لاحقاً، أضف مليليترين من وسط MBMEC إلى كل بئر لإيقاف عملية التريبسين. ثم، انقل الخلايا المجمعة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 milliliter وقم بطرد العينة مركزياً عند 700 times g لمدة ثماني دقائق عند درجة حرارة أربع degrees Celsius.

بعد ثماني دقائق، تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في 1 mL من وسط MBMEC الخالي من puromycin. ولعد الخلايا، اخلط 90 µL من trypan blue بتركيز 0.04%. وباستخدام 10 µL من معلق الخلايا، اسحب 10 µL من الخليط بواسطة الماصة وضعها بين الغطاء الزجاجي وغرفة عد الخلايا (hemocytometer).

بعد ذلك، يتم استزراع 2 × 10⁴ من الخلايا في كل قطعة إدخال. أضف 810 µL من وسط MBMEC إلى الحجرة السفلية من كل بئر، ثم ضع الطبق الذي يحتوي على قطع الإدخال في الحاضنة حتى يحين وقت البدء في قياس TEER. ولتحفيز الخلايا التائية الموجبة لـ CD4، يتم طلاء طبق ذو قاع مستدير يحتوي على 96 بئراً مسبقاً بجسم مضاد anti-mouse CD3 منقى بتركيز نهائي محدد لمدة ثلاث ساعات عند 37 °C.

بعد عزل الخلايا التائية، اغسل الطبق المطلي مسبقاً مرتين باستخدام PBS. بعد ذلك، أضف أجساماً مضادة منقاة لـ anti-CD28 إلى الخلايا التائية المعزولة بتركيز نهائي مطلوب وامزجها جيداً. ثم، قم بتحضين الخلايا التائية واتركها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة تتراوح بين يومين إلى ثلاثة أيام.

لإعداد قياس TEER، ضع وحدة الـ 24 بئراً الخاصة بجهاز TEER في غطاء التدفق الصفائحي. قم بإزالة الأغطية وضع الحشوات التي تحتوي على MBMECs في الجهاز باستخدام الملقط. بعد ذلك، انقل بواسطة الماصة 810 µL من الوسط الغذائي الطازج إلى الحجرة السفلية لآبار الوحدة، مع إضافتها بعناية بين الحشوة وجدار بئر الوحدة.

بعد ذلك، أغلق الأغطية وضع الجهاز في الحاضنة. صِل الجهاز بالكمبيوتر. ثم، قم بتشغيل وحدة التحكم في الجهاز وافتح البرنامج.

في النافذة المنبثقة، حدد المربعات "New Measurement" و "Check show TER" و "show Ccl". ثم اضغط على start. بعد إتمام القياس الأول، حدد "check all wells" في علامة التبويب Results لرؤية جميع قيم TEER و Ccl.

بعد ذلك، قم بحفظ الملف. ثم اختر النقطة الزمنية للمزارع المشتركة بين خلايا MBMECs والخلايا التائية عندما تكون قيمة Ccl مستقرة وأقل من 1 µF/cm² وتكون قيمة TEER قد وصلت إلى مستواها الأقصى. افحص بعناية قيم TEER وCcl المطلقة واستبعد الآبار التي لم تطور فيها خلايا MBMECs طبقات أحادية متلاحمة بما يكفي عن طريق إلغاء تحديد هذه الآبار.

قم بتجميع بقية الآبار عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على الآبار واختيار "add well to new average well". قم بتسميتها في النافذة المنبثقة وكرر العملية لجميع الآبار الفردية المراد تجميعها. ثم تحقق من جميع الآبار المتوسطة للتأكد من أن جميعها تمتلك نفس الظروف الأولية قبل الزرع المشترك. في علامة تبويب التجربة، اضغط على إيقاف مؤقت.

افصل الجهاز وأخرجه من الحاضنة. بعد ذلك، قم بإزالة الأغطية داخل غطاء التدفق الصفائحي. تالياً، قم بسحب جزء من الوسط من الإدراج الموجود في حجرة البئر العلوية.

أضف الخلايا التائية (T cells) إلى خلايا MBMECs عن طريق سحب 150 microliters من الوسط بدقة باستخدام الماصة. بعد ذلك، أعد توصيل الجهاز واضغط على استئناف القياس. وبعد مرور 24 ساعة، اضغط على إيقاف في علامة تبويب التجربة واحفظ الملف.

يظهر هنا المورفولوجيا المغزلية في التلوين المناعي الفلوري لـ PECAM-1 و Cldn-5 بعد خمسة أيام من عزل MBMECs. وفيما يلي قيم TEER و Ccl قبل وبعد تقسيم الآبار الفردية قبل إضافة الخلايا التائية (T cells). لا يُستخدم المنحنى الأزرق في التجربة لأن خلايا MBMECs في هذا البئر لم تطور قيمة TEER مرتفعة كما هو الحال في الآبار الأخرى.

في هذه التجربة، تم تحفيز 35 إلى 55 خلية T محددة موجبة لـ CD4 بطريقة نوعية للمستضد لمدة خمسة أيام. وقد استُخدمت خلايا T الساذجة والسيتوكينات المحفزة للالتهاب، interferon gamma و TNF-alpha كضابط سلبي وإيجابي على التوالي. هنا، تم تحفيز خلايا T بنفس الكمية من أجسام anti-CD3 و anti-CD28 المضادة، وأظهرت الخلايا التي استُزرعت لمدة ثلاثة أيام ميلاً أكبر لتعطيل الحاجز مقارنة بخلايا T التي استُزرعت لمدة يومين فقط.

تظهر النتائج هنا أن الخلايا التائية المستثارة، وليس السوائل الطافية الخاصة بها، تسببت في ضرر جسيم للخلايا البطانية في الحاجز الدموي الدماغي للفأر (MBMECs)، مما يشير إلى أن الاتصال المباشر بين الخلايا التائية وخلايا MBMECs أمر بالغ الأهمية لتعطيل الحاجز. ومن ناحية أخرى، أدى إضافة مثبط granzyme b الثاني إلى مزرعة الخلايا التائية إلى استعادة سلامة خلايا MBMEC بدرجة أكبر، مما يشير إلى أن الجزيء المحلل للخلايا يلعب دوراً هاماً في التسبب في تلف خلايا MBMEC وما يتبع ذلك من انخفاض في TEER. بمجرد إتقان هذه التجربة، يمكن إجراؤها في غضون 12 يوماً إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر اختيار النقطة الزمنية الصحيحة لإعداد المزرعة المشتركة للخلايا التائية والخلايا البطانية.

يمكن استخدام مقاييس أخرى بعد اتباع هذا الإجراء، مثل المجهر الفلوري المناعي، وقياس التدفق الخلوي، ومقاييس الاحتمالات. وذلك للإجابة على أسئلة إضافية، مثل: كيف يؤثر هذا التفاعل على نفاذية تعبير جزيئات الوصلات المحكمة ومدى انتقال الخلايا التائية؟ وقد مهدت هذه التقنية بعد تطويرها الطريق للباحثين في مجال المناعة العصبية لاستكشاف اضطرابات المناعة الذاتية في الجهاز العصبي المركزي لدى الفئران.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تتكون لديك فكرة جيدة عن كيفية تقييم التأثيرات المباشرة بين الخلايا التائية المنشطة والخلايا البطانية فيما يتعلق بسلامة ونفاذية الحاجز الدموي الدماغي.