استخدام متعدد المفلورة الأحماض الصفراوية و

الهدف العام من هذا الإجراء هو وسم الأحماض الصفراوية بفلور غير مشع يوجد طبيعياً، وذلك لقياس تركيزها في المرارة باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) لتقييم نقل الأحماض الصفراوية في الحيوانات الحية. ويمتلك هذا النهج إمكانية لتحديد الأفراد الذين يعانون من الإسهال المزمن والذين يجب علاجهم من سوء امتصاص الأحماض الصفراوية. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذا النهج في أنه لا يتطلب التعرض للإشعاعات المؤينة، فضلاً عن امتلاكه إمكانات ترجمية كبيرة لكل من الأبحاث السريرية والممارسة الطبية.

لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما أدركنا عدم وجود اختبارات سريرية عملية في الولايات المتحدة للكشف عن ضعف نقل أحماض الصفراء في الأمعاء. ابدأ بملء محقنة سعة 1 مل بالحجم المناسب من المحلول المخزون لحمض الصفراء المسمى بالفلور، وقم بتركيب إبرة تغذية معدية ذات طرف كروي ومنحنية مقاس 20 وبعرض 1.5 بوصة. بعد ذلك، استخدم الإبهام والسبابة للإمساك بالفأر بإحكام من الجلد الرخو في مؤخرة الرقبة، واستخدم الأصابع المتبقية للإمساك بالجلد في أسفل الظهر والذيل.

أمسِك الحيوان في وضع قائم، ثم مرر إبرة التغذية القسرية (gavage) على طول جانب وسقف الفم وصولاً إلى المريء ثم إلى المعدة. عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة، قم بإجراء شق جلدي في خط منتصف البطن من منطقة العانة إلى الناتئ الخنجي، يليه شق مماثل عبر غشاء البريتون للكشف عن أعضاء البطن دون ثقب الحجاب الحاجز. بعد ذلك، استخدم مشبكاً بطول خمس بوصات لرفع الناتئ الخنجي، مما يكشف التجويف البطني العلوي.

باستخدام الملاقط وأداة غير حادة، قم بتشريح وإزاحة الكبد جانبًا للكشف عن المرارة. بعد ذلك، ضع مشبكًا بطول أربع بوصات عبر القناة الصفراوية المشتركة واقطع الرباط الذي يربط القطب العلوي للمرارة بالحجاب الحاجز، مما يسمح بنقل المرارة إلى الجانب الأيمن من البطن. يجب توخي الحذر وتثبيت القناة الصفراوية المشتركة بالمشبك في أسرع وقت ممكن بعد عملية فتح البطن لتجنب تمزق الكبد أو تفريغ المرارة عن طريق الخطأ.

بعد عملية نزف الدم، انقل الدم الذي تم جمعه إلى أنبوب مهيمن عليه بالهيبارين سعة 1.5 ملليلتر لإجراء عملية الطرد المركزي. قم بترسيب البلازما باستخدام أربعة أجزاء من الأسيتونيتريل ثم أعد عملية الطرد المركزي لعينة الدم. بعد ذلك، قم بتحليل السائل العلائق باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة ومطيافية الكتلة.

لتحرير المرارة، قم بإجراء تشريح كليل للأنسجة المحيطة، يليه قطع القناة الصفراوية العامة أسفل الملقط. زن المرارة المستأصلة، ثم ضع النسيج في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5-milliliter وأزل الكبد. لاستخلاص الأنسجة، أضف 75%acetonitrile و 25%water وقم بتجانس 100 milligrams تقريباً من الكبد والمرارة بأكملها في مجانسات أنسجة زجاجية مقاس 21 فردية على الثلج.

انقل العينات إلى أنبوب Eppendorf سعة 1.5 ملiliter ثم قم بالطرد المركزي. بعد ذلك، خفف المستخلصات حسب الاقتضاء وقم بقياس كمية محتويات حمض الصفراء باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة ومطياف الكتلة. عند نقطة النهاية التجريبية المناسبة، قم بتطهير الجزء الداخلي من الفخذ الأيسر للفأر المخدر وأدخل قسطرة إبرة قياس 24 وبعمق 0.75 إنش تحت الجلد من خلال الفخذ وصولاً إلى التجويف البطني.

قم بإزالة الإبرة، مع ترك القسطرة داخل الصفاق في مكانها. انقل الفأر إلى سرير الحيوانات في ماسح الرنين المغناطيسي (MRI) وثبّت وسادة حرارية يتم التحكم في درجة حرارتها. وصّل القسطرة بقطعة من الأنابيب المعقمة بطول 72 بوصة، ثم وصّل هذه الأنابيب بمحقنة معقمة سعة 1 ملليلتر للحفاظ على التخدير طوال فترة الإجراء.

بعد التأكد من عدم وجود معادن بالقرب من الماسح الضوئي، استخدم ملف رنين مغناطيسي خطي حجمي مزدوج الضبط للفلور والبروتون لإرسال واستقبال إشارات الترددات الراديوية. ثم استخدم تسلسل اللقطات السريعة ذات الزاوية المنخفضة للحصول على صور لفروة الرأس مكونة من ثلاث شرائح لمعايرة النظام والتحقق من وضع الحيوان. لبدء التجربة، انقر فوق زر إشارة المرور للحصول على صور رنين مغناطيسي بروتونية متعددة الشرائح باستخدام تسلسل الاستحواذ السريع مع الاسترخاء والتعزيز في المقطع العرضي للعينة.

أخيرًا، انقر فوق زر GOP في نافذة أداة التحكم في مقياس الطيف للحصول على صور الفلور باستخدام تسلسل لقطات ثانية سريعة بزاوية منخفضة في المنطقة ذاتها. وباستخدام هذه الطريقة، يمكن قياس تركيز عالي الانتقائية لحمض الصفراء متعدد الفلورة، أو MFBA، في المرارة، وهو تركيز أعلى بألف مرة من المستويات الملحوظة في الكبد أو البلازما، وهو ما لا يتوافق مع المستويات الفسيولوجية لأحماض الصفراء. وكما هو متوقع بالنسبة للحركية الفسيولوجية للدورة الكبدية المعوية لحمض الصفراء، تظهر ذروة تركيزات MFBA في المرارة بعد مرور أربع إلى سبع ساعات من الجرعة الفموية.

بالفعل، بعد مرور ساعتين ونصف إلى أربع ساعات من التغذية القسرية الفموية بـ MFBA، تظهر إشارات الفلور المنبعثة مما يبدو أنه القناة الصفراوية المشتركة وإشارة أكثر قوة منبعثة من المرارة. وبحلول الساعة السابعة إلى الثامنة والنصف، لا يتم رصد إشارة القناة الصفراوية المشتركة بعد، وتزداد إشارة الفلور في المرارة لتصل إلى نفس شدة الإشارة المنبعثة من نموذج MFBA المحاكي المجاور. أما في الفئران التي تعاني من نقص في ناقل أحماض الصفراء المعتمد على الصوديوم القمي، والتي تظهر انخفاضاً في امتصاص الأمعاء لأحماض الصفراء، فيحدث انخفاض بنحو 22 ضعفاً في تركيز MFBA مقارنة بالحيوانات البرية الضابطة.

في الواقع، بينما تم اكتشاف إشارة فلور قوية في المرارة لدى الفئران من النوع البري، لم تظهر إشارة فلور مقابلة في الحيوانات التي تعاني من نقص في ناقل حمض الصفراء المعتمد على الصوديوم القمي، مما يؤكد أن MFBA يتم التعامل معها بشكل مشابه لأحماض الصفراء الفسيولوجية، وأن تصوير MRI لـ MFBA يمكن استخدامه للكشف عن ضعف الامتصاص المعوي لأحماض الصفراء. وبمجرد إتقان الإجراء وتنفيذه بشكل صحيح، يمكن إتمام عملية فتح البطن وسحب الدم وشق المرارة والكبد في غضون 20 دقيقة. أما عملية اكتساب الإشارة أثناء تصوير MRI فستستغرق من ساعة ونصف إلى ساعتين.

بعد تطوير هذه التقنية وتسويقها، سيكون لديها القدرة على تمهيد الطريق لاستكشاف دور نقل أحماض الصفراء المعوية في الفسيولوجيا والأمراض لدى الحيوانات الصغيرة والبشر على حد سواء. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية إعطاء أحماض الصفراء الموُسمة بمواد غريبة للحيوانات الصغيرة وقياس امتصاصها في الكبد والمرارة عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي MRI أو عبر شق الأعضاء.