إنتاج الخلايا الجذعية المحفزة من الفأر الأمنيوسي الخلايا السوائل عن طريق نظام ينقول

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل وإعادة برمجة خلايا السائل الأمنيوسي في الفئران باستخدام نظام الينقولات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تنفيذها بسهولة. في بيئة علاجية ، يمكن تمييز الخلايا من أجنة الأمراض البشرية إلى الخلايا ذات الأهمية لاختبار المخدرات أو هندسة الأنسجة ، من أجل إعداد طريقة أخرى للعلاج الخاص بالمريض قبل الولادة.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية للبرمجة. نظام الينقولات فعال في أنواع الخلايا المختلفة. إنه أكثر ملاءمة للنهج السريري فيما يتعلق بالنواقل الفيروسية ويسمح بإنتاج خلايا IPS الخالية من الأكسين.

لبدء العزل ، قم بتنظيف جدار بطن السد باستخدام 70 في المائة من الإيثانول. باستخدام المقص ، قم بإجراء شق البطن في خط الوسط ، مع شق طول جدار البطن للوصول إلى تجويف البطن. استخدم الملقط لكشف الرحم ثم استئصاله باستخدام المقص.

انقل الرحم إلى طبق 100 ملم مملوء ب 1xPBS معقم واحتفظ به على الثلج. ضع الطبق تحت مجهر مجسمة بتكبير 10 أضعاف وامسك الرحم بالملقط أثناء إزالة جدار الرحم بالمقص ، مع الحرص على تجنب إتلاف أغشية الجنين. اجمع الأجنة في طبق 100 ملم مليء ب 1XPBS معقم وضعه على الثلج.

أمسك المشيمة لجنين واحد بالملقط الدقيق وانقله إلى طبق نظيف 100 ملم. هنا ، قم بإزالة كيس صفار البيض بعناية. قم بتعطيل السائل السلوي باستخدام الملقط وباستخدام حقنة الأنسولين ، واجمع 30 ميكرولتر من السائل الأمنيوسي.

انقل السائل إلى قارورة مخروطية سعة 15 ملليلترا. كرر هذه العملية لكل جنين ، وجمع السائل في نفس القارورة في كل مرة. بعد ذلك ، اغسل كل جنين ب 1XPBS معقم مكمل بمصل بقري جنيني واحد بالمائة واجمعه في أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر مع السائل الأمنيوسي.

قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 145 مرة G لمدة خمس دقائق ثم تحت غطاء التدفق الصفحي ، قم بإزالة المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا المحببة في ملليلترين من وسط زراعة السائل الأمنيوسي. خذ صفيحة من ستة آبار مغلفة بالجيلاتين تحتوي على الخلايا الليفية الجنينية المعالجة بالميوميسين سي أو MEF ثم قم بزرع ملليلترين من الخلايا على اللوحة.

قم بزراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون ، وقم بتغيير الوسط كل يومين. استمر في الزراعة لمدة سبعة أيام حتى تصبح الخلايا جاهزة للتعداد. لبدء التعدي ، في أنبوب الطرد المركزي الدقيق ذو النقطة الواحدة خمسة ميلفيصل ، امزج ميكروغراما واحدا من بلازميد الينقولات مع نقطة صفر خمسة ميكروغرامات من البلازميد عبر الترانسبوساز ونقطة الصفر خمسة ميكروغرامات من البلازميد المنشط التتراسيكلين العكسي.

خفف إلى 100 ميكرولتر باستخدام d-man. أضف ثمانية ميكرولترات من كاشف التعدي إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على الحمض النووي. احتضن هذا المزيج لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

بأخذ صفيحة الآبار الستة مع خلايا AF للفأر ، أضف 100 ميكرولتر من خليط الحمض النووي لعامل التعدي لكل بئر ، وتوزيعها عن طريق الدوران اللطيف بحجم نهائي يبلغ ملليلترين لكل بئر. اترك الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، قم بإزالة وسط الثقافة ثم قم بتغذية كل بئر من الخلايا بملليلترين من وسط iPS AF الطازج المكمل بنقطة واحدة وخمسة ميكروغرام لكل مليلتر من الدوكسيسيكلين للحث على التعبير عن عوامل ياماناكا.

قم بتغذية الخلايا يوميا بوسط طازج يحتوي على دوكس دون مرور من هذه النقطة فصاعدا. راقب الخلايا تحت مجهر الإزهار في غضون 24 ساعة من أول علاج للدوكسيسيلسين للبحث عن أي تعبير mCherry ويوميا من هذه النقطة فصاعدا لتكوين المستعمرة. بمجرد ملاحظة تكوين المستعمرة ، اختر مستعمرات مفردة في 50 ميكرولترا من وسط زراعة الخلايا.

بعد ذلك ، قم بنقلها بالتتابع إلى آبار منفصلة من لوحة زراعة أنسجة 96 بئر مع mytomycin c المعالجة MEF. في اليوم التالي ، أضف 50 ميكرولترا من التربسين إلى كل بئر واحتضن لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية لفصل المستعمرات إلى خلايا مفردة. بعد الحضانة ، قم بتحريك السائل لأعلى ولأسفل لتفكيك المستعمرات بشكل أكبر.

انقل 50 ميكرولترا من مزيج خلايا التربسين إلى بئر جديد يحتوي على MEF معطل ثم أعد الخلايا إلى الحاضنة. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 60 إلى 70 في المائة ، قم بتقسيمها إلى بئر جديد من صفيحة 24 بئرا ثم استمر في الحضانة في درجة حرارة الغرفة. بمجرد أن تصل هذه الخلايا إلى 60 إلى 70 في المائة من التقاء ، اقلب الخلايا من واحد إلى اثنين إلى بئرين ، أحدهما يحتوي على الدوكسيسيكلين والآخر دون التحقق من أن المستعمرات ستنمو أيضا في غياب الدوكسيسيكلين.

استمر في الحفاظ على مستعمرات IPS AF والوسط المستقل الدوكسيسيكلين على MEF المعطل عند 37 درجة مئوية في خمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. قم بتغيير الوسط يوميا حتى تصبح الخلايا جاهزة للتلوين والتصوير واستخراج الحمض النووي الريبي. هنا ، تعبر الخلايا الإيجابية GFP السائلة السلوية المستحثة عن الدوكسيسيكلين المستقرة عن علامات جنبة القدرة المطلوبة لتأكيد إعادة البرمجة الناجحة.

أظهر تحليل RTPCR باستخدام خلايا R1 ES كعنصر تحكم تعبيرا عن علامات الجنبة المستحثة في وجود أو عدم وجود الدوكسيسيكلين. كما لوحظ التعبير عن جين التدبير المنزلي ، بيتا اثنين من ميكروغلوبولين ، في جميع أنواع الخلايا الثلاثة. تم تلطيخ الأورام المسخية المعزولة من الفئران المحقونة بالخلايا الجنبية المستحثة بالمناعة.

يؤكد الكشف عن بروتين ألفا الجنيني ، وأكتين العضلات الملساء ألفا ، وبيتا ثلاثة توبولين في الكتل تمايز الخلايا إلى جميع الطبقات الجرثومية الثلاث ، الأديم الظاهر ، والأديم المتوسط ، والأديم الباطن. علاوة على ذلك ، يؤكد تحليل RTPCR للأجسام الجنينية في المختبر والخلايا المسخية في الجسم الحي التعبير عن جينات علامات الطبقة الجرثومية للأديم المتوسط والأديم الباطن والأديم الظاهر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل وإعادة برمجة خلايا السائل الأمنيوسي في الفئران.

هذا إجراء بسيط وآمن يمكن تطبيقه أيضا على خلايا السائل الأمنيوسي البشري من عينة تم الحصول عليها من التشخيصات الروتينية أو العمليات القيصرية.