على المدى الطويل عالية الدقة حيوي داخلي المجهري في الرئة مع فراغ استقرت النافذة التصوير

الهدف العام من هذه الطريقة هو إجراء تصوير طويل الأمد وعالي الدقة على مستوى الخلية الواحدة للرئة السليمة باستخدام نافذة تصوير مثبتة بالتفريغ. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال أبحاث السرطان؛ مثل طبيعة التفاعلات التي تحدث بين السدى والخلايا الورمية خلال الخطوات الأولى من عملية الانتقال الورمي. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية تصور الرئة الحية والسليمة نظرياً بدقة الخلية الواحدة لمدة تصل إلى 12 ساعة.

ابدأ بربط قطعة طولها ثلاث بوصات من خيط جراحي 2-0 بقسطرة رغامية، على ارتفاع ربع بوصة فوق الجلبة، باستخدام عقدة مزدوجة. ثم ضع مرهم العين في عيني فأر مخدر واستخدم كريم إزالة الشعر لإزالة الشعر من الجانب الأيسر للحيوان، بدءاً من الخط المتوسط للصدر وصولاً إلى ربع الظهر، ومن الإبط إلى ما تحت القفص الصدري مباشرة. قم بتنظيف أي بقايا من الكريم وعقم الجلد المكشوف باستخدام 70% ethanol.

بعد ذلك، قم بإجراء التنبيب للحيوان. واربط خيط جراحي من مقاس 2-0 حول الخطم، أسفل الأسنان الأمامية. انقل الحيوان إلى منطقة الجراحة، مع الحرص على عدم إزاحة القساطر، ثم قم بتشغيل جهاز التنفس الاصطناعي.

قم بتوصيل جهاز التنفس الصناعي بالقثطرة الرغامية. بعد ذلك، ثبت القثطرة على الخطم والطرف الأمامي الأيسر بالقثطرة باستخدام شريط لاصق. بعد التأكد من عدم وجود استجابة لقرص إصبع القدم، استخدم مقصاً حاداً لإزالة سنتيمتر مربع واحد من الجلد فوق جدار الصدر الأيسر.

ارفع الوسادة الدهنية الثديية وقم بكيّ أي أوعية دموية مكشوفة. بعد ذلك، استأصل الوسادة الدهنية وأزل الطبقة العضلية وصولاً إلى القفص الصدري، مع الحرص على عدم قطع الوريد الإبطي عند قاعدة الطرف الأمامي. استخدم الملقط لرفع الضلع السادس.

بعد ذلك، وأثناء إمساك المقص الحاد بزاوية ضحلة قدرها خمس درجات، يتم قطع الضلع بالقرب من حافة الفتحة الموجودة في الجلد. يتم إزالة أربعة أضلع متتالية لتوسيع الفتحة في جدار الصدر، مما يؤدي إلى كشف فص الرئة بالكامل. ثم يتم نقل الفأر بعناية إلى منصة التصوير الخاصة بالمجهر.

مع إيقاف تشغيل المكنسة الكهربائية، املأ الغرفة الداخلية لنافذة التفريغ بمحلول PBS. اقلب الفأر وضع الرئة المكشوفة فوق نافذة غطاء شريحة التصوير بالتفريغ. قم بتشغيل المكنسة الكهربائية ببطء.

ضع حزام تثبيت، مصنوعاً من ورق المناديل المطوي إلى نصفين، مرتين فوق صدر الفأر وثبّت الحزام بشريط لاصق على لوحة المنصة. بعد ذلك، قم بتوصيل جهاز قياس تأكسج النبض بمخلب الحيوان. ثم ضع غرفة التحكم البيئية على المنصة وشغّل السخان للحفاظ على الفأر في درجة حرارة فسيولوجية.

عندما يكون الحيوان في الوضعية الصحيحة، قرّب العدسة الشيئية ذات الفتحة العددية 25 في 95 من غطاء الشريحة. في وضع الفلورة فوق البؤرية، اعرض قناة fitzy واضبط تركيز أنسجة الرئة. بعد ذلك، املأ حقنة معقمة بـ 100 µL من معلق الخلايا الورمية، وأزل حقنة PBS من قسطرة الوريد الذيلي، ثم قم بتوصيل حقنة الخلايا الورمية.

احقن الخلايا الورمية ببطء في الوريد الذيلي. بعد ذلك، أعد توصيل حقنة PBS بالقسطرة الوريدية الذيلية، وحدد موقع الخلايا الورمية في جميع أنحاء نسيج الرئة عبر عدسة المجهر العينية. الآن، استبدل حقنة PBS بحقنة محملة بـ 100 µL من rhodamine dextran، واحقن الـ dextran ببطء في الفأر عبر القسطرة الذيلية.

اتبع عملية حقن الديكستران بغسيل بمقدار 50 µL من محلول PBS المعقم. بعد ذلك، التقط صوراً عند كل موقع من مواقع الخلايا الورمية التي تم تحديدها مسبقاً لتصور تدفق وسلامة الأوعية الدموية. وبعد مرور أربع وعشرين ساعة على الحقن، يمكن تصور الخلايا الورمية المفردة وهي تتفاعل مع البلاعم والخلايا الوحيدة داخل الأوعية الدموية.

تتميز استقرارية التصوير بكونها تسمح بالحصول على مجموعات متتابعة من المقاطع العرضية (Z-stacks) للمجال، مما يتيح إمكانية إنشاء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد. يظهر هنا فسيفساء من مجالات التصوير بمقاس خمسة في خمسة، تغطي مجال رؤية بمساحة 890 micron، على مدار 205 دقيقة، على عمق 15 microns تحت سطح رئة تحتوي على آفة نقيلية واحدة، وذلك بعد 12 يوماً من الحقن. وعلى الرغم من اتساع مجال الرؤية، فإن الدقة العالية للإطارات الأساسية المكونة للفسيفساء تسمح برصد الأحداث تحت الخلوية، مثل انقسام خلية واحدة، كما يتضح من انفصال الكروموسومات.

يؤدي الحقن داخل الأوعية لـ dextran عالي الوزن الجزيئي وموسوم بفلورسنت إلى وسم تجويف الأوعية الدموية؛ ومع ذلك، يمكن لكرات الدم الحمراء وكريات الدم البيضاء الدوارة غير الموسومة أن تسد الـ dextran. وفي الشعيرات الدموية الصغيرة في الرئة، يؤدي هذا الانسداد إلى وميض في إشارة الـ dextran وفقدان تحديد حدود الأوعية الدموية. وتسمح الاستقرارية المكانية العالية، التي يوفرها هذا البروتوكول، بإجراء متوسط زمني لقناة الدم دون تشوش، مما يؤدي إلى استعادة الانسدادات المؤقتة.

يمكن بعد ذلك دمج قنوات الإشارة الأخرى فوق الأوعية الدموية لتوفير رؤية واضحة لحدود الوعاء. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إكمالها في غضون ساعة تقريباً إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة إجراء هذه العملية، من المهم تذكر الحرص على عدم قطع أي أوعية دموية كبيرة دون كيّها أولاً، وتجنب لمس أنسجة الرئة تماماً.

باتباع هذا الإجراء، يمكن تصور المراحل المبكرة من انتشار الخلايا الورمية وتكاثرها. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء التصوير الحي داخل الجسم في الرئة السليمة باستخدام نافذة تصوير مثبتة بالتفريغ. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجربتكم.