التصحيح المشبك تسجيل من خلايا النجمي عديم الاستطالات في جبل شقة إعداد Deafferentated شبكية العين الفأر

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء تسجيل مشبك التصحيح للخلية الكاملة من الخلايا العصبية الداخلية للشبكية في مستحضر شبكية الفأر المسطحة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال البيولوجيا العصبية للشبكية مثل تنوع الخلايا العصبية واتصالاتها المشبكية في ظل الظروف الطبيعية والمرضية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي الحفاظ على كل من الوصلات الرأسية والجانبية مما يسمح بدراسة دوائر شبكية العين ذات المكونات الجانبية الكبيرة.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن شبكية العين عبارة عن نسيج رقيق وحساس يجب التعامل معه بعناية وصبر. ومع ذلك ، فإن الممارسة هي أفضل طريقة لإتقانها. لبدء هذا الإجراء ، قم بلف مقل عيون الفأر في منشفة ورقية نظيفة لإزالة أي دم.

ثم اغمرهم في محلول Ringer للثدييات المكربونة. بعد ذلك ، قم بعمل ثقب على الأطراف بإبرة قياس 23 وقم بتقسيم مقل العيون عن طريق القطع على طول الأطراف بمقص صغير. ثم قم بإزالة القرنية والعدسة باستخدام ملقط دقيق.

لتركيب الشبكية بالكامل ، قم بتقشير الشبكية بأكملها برفق من الظهارة المصطبغة باستخدام ملقط دقيق وقم بعمل أربع قطع متعامدة من 1.5 إلى ملليمترين من الحافة باتجاه رأس العصب البصري. بعد ذلك ، اغمر غشاء النيتروسليلوز المثقوب في الطبق واسحب شبكية العين فوقه برفق مع وضع جانب GCL لأعلى. بعد ذلك ، ضع رأس العصب البصري في الفتحة المركزية عند تحضير شبكية العين بالكامل.

بعد ذلك ، انقل الغشاء مع شبكية العين إلى طبق نظيف آخر. قم بتسطيح شبكية العين برفق كصليب مالطي بفرشاة طلاء دقيقة وضع الحواف الأربعة فوق الثقوب. امسح غشاء النيتروسليلوز بقطعة من ورق الترشيح الجاف وقم بإزالة الغشاء الزجاجي والداخلي المحدد بالملقط وفرشاة الطلاء.

تأكد من أن جميع حواف الشبكية متصلة بالكامل بالغشاء قبل نقل المجموعة إلى غرفة التسجيل مع انزلاق غطاء زجاجي محكم الغلق في الأسفل. قم بتثبيت الغشاء على زلة الغطاء بشحم مفرغ وإعادة ترطيب شبكية العين بالمحلول الخارجي. احرص على عدم حبس أي فقاعات هواء أسفل التجميع.

بعد ذلك ، ضع الغرفة على مسرح المجهر المستقيم. قم بتعبئة الغرفة بمحلول خارجي مكربن 34 درجة مئوية بمعدل حوالي ثلاثة ملليلتر في الدقيقة. افحص شبكية العين تحت عدسة ذاتية 10x أولا.

بعد ذلك ، استخدم عدسة غمر الماء 60x لرؤية الخلايا العصبية GCL و INL تحت DIC وإعداد epifluorescent. لتصور tdTomato يعبر عن SACs ، استخدم مصدر ضوء LED أبيض مع مرشح إثارة يبلغ 554 نانومتر ومرشح انبعاث يبلغ 581 نانومتر. في هذا الإجراء ، قم بتصفية المحلول الداخلي من خلال مرشح حقنة في خيوط الردم المخصصة.

بعد ذلك ، أدخل الفتيل في ماصة دقيقة مسحوبة حديثا وقم بتوزيع المحلول الداخلي بالقرب من الطرف حتى يغطي المحلول سلك القطب الفضي لأكثر من خمسة ملليمترات. بعد ذلك، اربط الماصة الدقيقة على حامل قطب كهربائي بسحب شفط يمكن من خلاله ضبط الضغط داخل القطب الكهربائي عن طريق دفع أو سحب مكبس الأنبوب المتصل بحقنة بلاستيكية سعة 10 ملليلتر. بعد ذلك ، حدد موقع الماصة أسفل الهدف وخفضها إلى حوالي 100 ميكرومتر فوق شبكية العين.

في ظل وضع المتابعة الحالي ، استخدم إزاحة التيار المستمر لصفر إشارة جهد التيار المستمر الثابتة. قم بقياس مقاومة الماصة في ظل وضع المشبك الحالي عن طريق حقن تيارات موجة مربعة ذات سعة ثابتة من خلال الماصة أثناء وجودها في الحمام. قم بتحييد الفرق عن طريق تدوير مقبض Raccess واستخدام القراءة الموجودة عليه لحساب مقاومة الماصة.

بعد ذلك ، قم بإحضار القطب الكهربائي ببطء إلى حوالي 10 ميكرومتر فوق شبكية العين. قم بالضغط الإيجابي على القطب. بعد ذلك، شاهد الانعكاس يتغير بالقرب من طرف الماصة عندما يقترب من شبكية العين.

بسرعة ولكن برفق، قم بإجبار الماصة على الدخول إلى GCL وقلل الضغط الإيجابي على الفور. حرك الماصة نحو الخلايا العصبية المسماة وتجنب ملامسة الخلايا العصبية الأخرى والأوعية الدموية ونهاية الأقدام لخلايا مولر. استخدم ضغطا أكثر إيجابية ، إذا لزم الأمر ، لمنع انسداد القطب.

بعد ذلك ، ضع طرف الماصة بالقرب من الخلايا العصبية المسمى حتى تظهر الغمازة. بعد ذلك، حرر الضغط الإيجابي واترك غشاء البلازما يرتد مرة أخرى إلى طرف الماصة. قم بتطبيق 20 إلى 120 بيكو أمبير تيارا سالبا على الماصة للمساعدة في تكوين مانع تسرب جيجا أوم.

السماح لغشاء الخلية بالارتداد بعد إطلاق الضغط الإيجابي أمرا مهما لأن الختم الممتاز الذي يتشكل بشكل طبيعي بين الغشاء وفتحة الماصة مهم للحفاظ على مورفولوجيا الخلية بعد التسجيل. إذا لزم الأمر، استخدم شفطا لطيفا لسحب غشاء البلازما إلى الماصة. انتظر خمس دقائق بعد تكوين الختم لتمزق غشاء الخلية للسماح بإزالة المحلول الداخلي المنسكب عن طريق الصخم الفائق.

بعد تمزق الغشاء وأثناء وجوده في وضع المشبك الحالي ، قم بتشغيل توازن الجسر واضبطه باستخدام مقبض Raccess. سجل التيارات المثيرة والمثبطة بعد المشبكي في وضع مشبك الجهد عن طريق تثبيت الخلية عند إمكانات الانعكاس. بعد التسجيل ، قم بإزالة الماصة برفق من سوما.

انقل التجميع من الغرفة إلى طبق نظيف. بعد ذلك ، افصل شبكية العين وأعد توصيلها بغشاء نيتروسلولوز آخر مسطح دون ثقب ثقوب لضمان تسطيح شبكية العين أثناء التثبيت. الأنسجة جاهزة الآن للتلطيخ.

تظهر هذه الصور أنه يمكن التعرف على الخلايا الكولينية في كل من GCL و INL بشكل موثوق بواسطة tdTomato الفلوري واستهدافها لتسجيل مشبك التصحيح للخلية بأكملها تحت DIC. يمكن الكشف عن تذبذب إمكانات الغشاء من خلال تسجيل المشبك الحالي ، ويتم الكشف عن التذبذب الذي تحركه التيارات المشبكية المثبطة والمثيرة من خلال تثبيت الخلايا عند صفر مللي فولت وسالب 75 مللي فولت على التوالي في ظل ظروف مشبك الجهد. هنا ، يشير التوصيف النسيجي بعد hoke للخلايا المسجلة إلى التشكل التغصني النموذجي SAC ومستويات التقسيم الطبقي في IPL.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تأمين مجموعة غشاء شبكية العين في غرفة التسجيل وإعادة الترطيب دون حبس فقاعات الهواء تحتها بطريقة بإحكام ودقيقة لتوفير عينة قابلة للتسجيل. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تسجيلات المشبك المزدوجة التصحيح من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ما إذا كانت تذبذبات الخلايا المتعددة المستهدفة مدفوعة بنفس الآليات المتشابكة. بعد تطويرها ، تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البيولوجيا العصبية للشبكية لاستكشاف تزامن التذبذب بين الخلايا العصبية المجاورة للشبكية في شبكية العين المتدهورة المستقبلة للضوء.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إزالة الفكاهة الزجاجية وإعداد حامل مسطح للشبكية لتسجيل مشبك التصحيح المستهدف على نطاق واسع من الخلايا العصبية الداخلية في الشبكية.