سرعة اقتناء الصور 3D باستخدام عالية الدقة Episcopic المجهر

الهدف العام من هذا البروتوكول هو الحصول بسرعة على صور رقمية ثلاثية الأبعاد عالية الدقة للعينات البيولوجية باستخدام معدات المختبرات القياسية. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأحياء التنموي من خلال تصور وديناميكيات السمات المورفولوجية المعقدة. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها تستخدم معدات مختبرية قياسية وتتطلب الحد الأدنى من الخبرة السابقة.

سيوضح الإجراء جونغانغ هوانغ ، طالب دراسات عليا من مختبري. بعد تشريح الجنين وتثبيته كما هو موضح في بروتوكول النص ، استبدل المثبت بمحلول المقاصة ، وقم بتدوير العينة برفق على كرسي هزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوع إلى أسبوعين. في نهاية الحضانة ، انقل العينة إلى 10٪ فورمالين واتركها على الروك لمدة يومين آخرين.

في اليوم الثالث ، اغسل العينة في PBS لمدة ثلاث غسلات لمدة خمس دقائق. ثم قم بتجفيف العينات في سلسلة الإيثانول الصاعدة في درجة حرارة الغرفة ، على هزاز لطيف لمدة ساعتين لكل تركيز. بعد تجفيف الإيثانول بنسبة 100٪ ، انقل العينة إلى محلول تلطيخ لمدة ساعة واحدة ، محمية من الضوء.

بعد ذلك ، استبدل المحلول بمحلول تلطيخ جديد لوضع العلامات الليلية على العينة. في صباح اليوم التالي ، اغمر العينة في خليط من حجم واحد إلى حجم من محاليل التسلل والتلوين المحضرة حديثا لمدة ثلاث ساعات على الأقل على كرسي هزاز عند أربع درجات مئوية. في نهاية الحضانة ، انقل الجنين إلى محلول التسلل لمدة ثلاث ساعات حضانة هزاز أخرى.

ثم استبدل المادة الطافية بمحلول تسلل جديد لمدة ثلاثة أيام أخرى من التأرجح عند أربع درجات مئوية. في اليوم الرابع ، قم بتوجيه الجنين في قالب تضمين وضع القالب على الجليد. امزج المحلول B مع محلول التسلل ثم اغمر القالب برفق في محلول التضمين البارد عند أربع درجات مئوية.

بعد حوالي ثلاث ساعات ، استخدم طرفا للتأكد من أن المحلول قد تصلب ، وادفع العينة خارج القالب. قم بقص أي مواد تضمين زائدة ، ثم أعد توجيه كتلة العينة في قالب جديد في اتجاه متقاطع. بعد ذلك ، ضع الإعداد بالكامل على الجليد في غطاء الدخان.

أضف محلول التضمين برفق إلى القالب الجديد حتى يتم غمر القالب. ثم ضع حامل الكتلة أعلى القالب. بعد ثلاث إلى أربع ساعات ، انزع قالب التضمين وضع الكتلة تحت مجهر استريو بإضاءة مائلة لتحديد موضع العينة داخل الكتلة.

على وجه الكتلة ، ضع علامة على خطوط الشبكة حول العينة واستخدم الخطوط كأدلة لتقليم أي مواد تضمين زائدة. لتصوير العينة ، قم أولا بتثبيت الكتلة على ميكروتوم ، واحصل على قطع سطح جديد للعينة. ثم قم بتركيب مجهر تكبير استريو أفقيا في مواجهة وجه كتلة العينة ، وقم بتشغيل المجهر والكمبيوتر المصاحب.

بعد ذلك ، ابدأ تشغيل برنامج الحصول على الصور واستخدم وضع العرض المباشر في برنامج التصوير لتركيز البصريات على وجه الكتلة. قم بمحاذاة المجهر والميكروتوم حسب الحاجة ، بحيث يكون وجه الكتلة في منتصف معين المنظر. تتمثل إحدى أهم خطوات هذا الإجراء في الحصول على صور في الموضع المنزلي الثابت للميكروتوم.

اضبط التكبير/التصغير للتأكد من أن وجه الكتلة بالكامل داخل معين المنظر. ثم حدد مرشح البروتين الفلوري الأخضر. تابع قص الكتلة مسبقا حتى تظهر أنسجة العينة ، وأعد تركيز الصورة حسب الحاجة.

بعد قياس وقت التعرض وضبطه يدويا ، احصل على صور لوجه الكتلة واحفظها بعد كل قص جديد ، وسجل معلمات الحصول على الصور المهمة. في نهاية جلسة التصوير، قم بتصدير جميع ملفات الصور وتحويلها إلى تنسيق JPEG، واستخدم برنامج معالجة الصور المناسب لعكس جميع الصور الأصلية، وضبط سطوع الصور وتباينها حسب الضرورة. قم بتحميل جميع الصور المعالجة إلى برنامج تصور ثلاثي الأبعاد ، باتباع التعليمات.

قم بمحاذاة جميع الصور باستخدام الوضع التلقائي ، واعرض النتائج ثلاثية الأبعاد وثنائية الأبعاد. في هذه الصورة التمثيلية لمنظر سطح كامل لجنين فأر 15.5 يوم جنيني تم إعداده وتصويره كما هو موضح للتو. يمكن ملاحظة السمات المورفولوجية التفصيلية للجلد ، بما في ذلك وسادات الشعيرات وبصيلات الشعر النامية.

الأهم من ذلك ، أن دقة عرض القسم الافتراضي لعينة اليوم الجنيني 15.5 التي تم تصويرها بهذه الطريقة تشبه القسم النسيجي القياسي. بمجرد إتقان الإجراء بأكمله بعد المعالجة المسبقة بمحلول المقاصة يمكن أن تكتمل في أسبوع واحد ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على محلول التلوين محميا من الضوء عند أربع درجات أثناء خطوة التسلل والتضمين.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل تلطيخ المقياس ، للإجابة على سؤال إضافي حول أنماط التوزيع المحددة لأنواع الخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام معدات المختبرات للحصول على صور ثلاثية الأبعاد عالية الدقة للعينات البيولوجية لتحليلها المورفومتري. لا تنس أن العمل مع محلول التثبيت والتلطيخ والتسلل يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، وأن الاحتياطات مثل العمل في غطاء الدخان وارتداء القفازات يجب دائما اتخاذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.