إعداد و

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح عملية تخليق المسبار القائم على النشاط، ARN 14686، المخصص لإنزيم N-acylethanolamine acid amidase، أو NAAA، ووصف استخدامه للكشف عن الإنزيم النشط حفزيًا في مستخلصات الخلايا ومقاطع الأنسجة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على تساؤلات حول وظيفة NAAA في الجسم الحي، مما يوفر رؤى حول تنشيط NAAA في ظروف فسيولوجية ومرضية مختلفة، مثل الأمراض الالتهابية والأمراض التنكسية العصبية. وتكمن ميزتها الرئيسية في أن معالجة بسيطة تتبع تفاعل NAAA مع المسبار، مما يعطي معلومات موثوقة عن حالة تنشيط الإنزيم في الجسم الحي.

تتمثل ميزة أخرى في أن مسبارنا، على عكس الأجسام المضادة النوعية، لا يكشف إلا عن الشكل النشط للإنزيم، وهو أمر مفيد لتحديد الحالة عبر المجهر الفلوري. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً حاسماً لأنها تجمع بين خبرات مختلفة تكتمل لتشكل قصة متكاملة، بدءاً من التصنيع الصحيح وصولاً إلى تطبيقاتها النهائية. في دورق مستدير القاع سعة 50 milliliter، قم بإذابة 350 milligrams من undecynenol و3.5 milliliters من dichloromethane الجاف.

ثم أضف 25 milligrams من DMAP و 530 milligrams من DPC إلى هذا المحلول. اخلط المزيج في درجة حرارة الغرفة لمدة 16 ساعة. وبعد مرور 16 ساعة، أضف 20 milliliters من dichloromethane إلى المحلول.

انقل الخليط إلى قمع فصل. أضف 15 milliliters من الماء. رج الخليط واتركه حتى تنفصل الطورتان.

بعد ذلك، افتح الصنبور وجمع الطور العضوي الموجود في الأسفل، ثم أغلق الصنبور وانقل الطور العضوي مرة أخرى إلى القمع. أضف 15 milliliters من محلول بيكربونات الصوديوم المشبع إلى الخليط. رجّ قمع الفصل واترك الطورين ينفصلان.

بعد تجفيف الطبقة العضوية باستخدام كبريتات الصوديوم، قم بترشيحها عبر القطن في دورق مستدير القاع متعدد الطبقات. ثم بخر الطبقة العضوية حتى الجفاف تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار. قم بوزن الدورق والحصول على 600 milligrams من الزيت، والذي يمثل خليطاً من pyridyl undecynyl carbonate و undecynol two oxypyridine carboxylate بنسبة 1.7 إلى 1.

في دورق مستدير القاع سعة 10 milliliter، أذب 60 milligrams من oxo asetydenol ammonium asetate في 2 milliliters من dichloromethane الجاف. برد المحلول حتى صفر °C في حمام ثلجي، ثم أضف 81 µL من diazapropalethylamine تدريجياً على شكل قطرات. بعد ذلك، أذب 350 milligrams من الخليط الخام الذي يحتوي على undecynol two oxypyridine carboxylate في 2 milliliters من dichloromethane الجاف.

أضف الخليط المذاب إلى المحلول وقم بالتحريك في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 ساعة. بعد ذلك، قم بتبخير المذيب حتى الجفاف تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار. قم بتنقية المركب عن طريق كروماتوغرافيا العمود باستخدام هلام السيليكا باستخدام جهاز كروماتوغرافيا العمود الآلي.

أولاً، قم بامتزاز العينة على هلام السيليكا. بعد موازنة العمود باستخدام cyclohexene، قم بتحميل العينة في الخرطوشة. قم بشطف العينة باستخدام ethyl acetate في cyclohexane بنسبة تتدرج من 0 إلى 100، مع تجميع القمم في أنابيب اختبار.

بخر المذيب من الأجزاء المقابلة للمركب حتى الجفاف تحت ضغط منخفض باستخدام مبخر دوار للحصول على 40 milligrams من مادة صلبة بيضاء. بعد التصفية الأولية للعينة كما هو موضح في البروتوكول النصي، أضف 11.3 µL من مخزون بتركيز 5 mM من azide polyethylene glyco biotin ثم قم بالرج باستخدام جهاز الفورتكس. بعد ذلك، أضف 11.3 µL من مخزون بتركيز 50 mM من TCEP المحضر حديثاً إلى العينة وقم بالرج باستخدام جهاز الفورتكس.

بعد خلط 34 µL من محلول عمل تم تحضيره حديثاً بتركيز 1.7 mM من TBTA مع 11.3 µL من محلول مخزون من كبريتات النحاس بتركيز 50 mM، أضف 45.3 mL من هذا المحلول إلى العينة وقم بعمل مزج دوامي (vortex). استخدم حاويات مصنفة. قم بحضن التفاعل عند درجة حرارة 25 °C لمدة ساعتين على الأقل.

بعد تحضين لمدة ساعة واحدة، راقب ترسيب البروتين ثم اخلط التفاعل. قم بطرد العينة مركزياً لمدة أربع دقائق عند 6,500 ×g في درجة حرارة 4 °C. بعد إزالة الراشح، أضف 750 µL من الميثانول البارد وأعد تعليق الراسب عن طريق الموجات فوق الصوتية باستخدام مسبار سونيكيتور لمدة خمس ثوانٍ.

ثم قم بطرد العينة مركزياً لمدة أربع دقائق بسرعة 6,500 ×g عند درجة حرارة 4 °C. ثم قم بإزالة السائل الطافي باستخدام سرنجة وإبرة. وبعد الغسل مرتين إضافيتين بالميثانول البارد، أضف 325 µL من 2.5% SDS في PBS إلى ركاز البروتين.

قم بإجراء المعالجة بالموجات فوق الصوتية للعينة ثلاث مرات لمدة خمس ثوانٍ. بعد ذلك، سخن العينة لمدة خمس دقائق عند 65 °C. وبعد المعالجة بالموجات فوق الصوتية، قم بطرد العينة مركزياً لمدة خمس دقائق بسرعة 6,500 ×g في درجة حرارة الغرفة.

ثم انقل السائل الطافي إلى أنبوب نظيف سعة 15 milliliter وأضف 1.4 milliliters من PBS إلى السائل الطافي لتخفيف تركيز SDS إلى 0.5%. ولإثراء streptavidin، قم أولاً برفع حجم العينة إلى 4.2 milliliters باستخدام PBS. ثم أضف 40 µL من معلق بتركيز 50% من streptavidin agarose المغسول مسبقاً باستخدام طرف ماصة مقطوع الطرف.

تُحضن المادة المخلوطة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة مع التدوير. وبعد الطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 1,400 ×g، يُزال السائل الطافي دون تجفيف ركازة الخرز. ويُستخدم السائل الطافي المتبقي لنقل الخرز إلى عمود دوران سعة 1 mL، ثم يُغسل العمود بالجاذبية باستخدام 1 mL من SDS بتركيز 1% في PBS.

استمر في غسل الحبيبات باستخدام يوريا بتركيز 6 molar متبوعة بـ PBS كما هو موضح في البروتوكول النصي. ثم استخدم 500 µL من PBS لنقل الحبيبات المغسولة إلى أنبوب سعة 1.5 mL. بعد طرد العينة مركزياً لمدة دقيقتين عند 1,400 ×g، اسحب السائل الطافي برفق باستخدام سرنجة وإبرة.

لاستخلاص البروتينات المرتبطة بالراتنج، أضف 25 µL من محلول الاستخلاص إلى كُتلة الراتنج المترسبة واحضنها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، تليها 15 دقيقة عند 95 °C. أضف ما يقرب من 400 µL من مزيج كيمياء النقر (click chemistry mix) إلى شرائح الأنسجة التي تم تحضيرها وفقاً للبروتوكول المكتوب. تأكد من أن الحجم المختار من مزيج كيمياء النقر كافٍ لتغطية الشرائح.

بعد ذلك، تُحضن شرائح الأنسجة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع حمايتها من الضوء. وعقب فترة التحضين، تُغسل العينات بمحلول PBS لمدة خمس دقائق، ثم بالميثانول البارد لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، تُغسل شرائح الأنسجة ثلاث مرات بمحلول مكون من 1% Tween 20 و0.5 mM EDTA في PBS لمدة دقيقتين.

أخيراً، اغسل الشرائح مرة أخرى باستخدام PBS لمدة خمس دقائق. وبعد التجفيف بالهواء، أضف قطرة من مادة التثبيت المانعة للتلاشي (antifade mountant) مع DAPI. أغلق العينات باستخدام أغطية شرائح (cover slips) وقم بتثبيتها باستخدام طلاء الأظافر (polish).

لتخليق المسبار، يتم تنشيط undecynenol بواسطة dipirydyl carbonate في وجود كمية حفازة من four dimethyl aminyl pyridine لإنتاج كربونات مختلطة، والتي تتفاعل بعد ذلك مع aminyl lactam؛ حيث يتفاعل beta lactam أو رأس المسبار مع الموقع النشط لإنزيم NAAA بينما يمكن وظيفياً تعديل alkyne الطرفي باستخدام علامة تقرير عبر كيمياء النقر (click chemistry). وقد استُخدم ARN 14 six eight six للكشف عن تنشيط NAAA في مستخلصات خلوية من قوائم جرذان ملتهبة عن طريق protein block. وفي الجرذان السليمة، لا يتم الكشف عن أي إشارة لـ NAAA.

وعلى العكس من ذلك، يُلاحظ في الجرذان المعالجة بمساعد فروند الكامل وجود حزمة بارزة تقابل NAAA النشط. ومن التطبيقات الأخرى لـ ARN 14 six eight six تصوير الأنسجة باستخدام المجهر الفلوري، حيث تمثل الخلايا الحمراء البلاعم السنخية التي تكون إيجابية لـ NAAA النشط.

يتوضع NAAA في بنيات حويصلية منتشرة كما هو ملاحظ عند تكبير أعلى. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية تخليق واستخدام ARN 14 six eight six للكشف عن NAAA النشط في الأنسجة، وذلك عن طريق لطخة البروتين ومجهر الفلوريسنت. بالإضافة إلى ذلك، ورغم أن هذا البروتوكول محدد لهدفنا، فإن تطبيقات المسبار التي وصفناها يمكن تعديلها بسهولة لتناسب مسابير أخرى قائمة على النشاط ومخصصة لأهداف غير NAAA.