طرق لدراسة الدهون التعديلات في العدلات وتشكيل لاحقة من الفخاخ خارج الخلية العدلات

الهدف العام من هذه الطريقة هو التحقيق في التغيرات في التركيب الدهني للعدلات أثناء إطلاق مصائد العدلات خارج الخلية باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة و HPLC. يمكن استخدام هذه الطريقة للحصول على معلومات أكثر تفصيلا حول الآليات التي تشارك في تكوين مصائد العدلات خارج الخلية ، أو التي سميت باختصار ، تكوين NET. الميزة الرئيسية لهذا الإجراء هي أنه يوفر معلومات عن دور الدهون في الوظيفة العامة للعدلات من خلال استخدام بروتوكول سهل المتابعة.

سيتم إثبات عزل الخلايا المشتقة من الدم البشري من قبل طالبة دكتوراه سابقة في مختبرنا ، أريان نيومان. وستساعدها فريدريك رونر. سيتم عرض إعداد الخلايا لتحليل الدهون من قبل غراهام بروغدن ، وهو ما بعد الدكتوراه في مختبري ودياب حسين ، طالب الماجستير في برنامج الكيمياء الحيوية.

لعزل العدلات المشتقة من الدم البشري ، ضع طبقة حوالي 20 مل من الدم على 20 مل من محلول دياتريزوات الصوديوم / ديكستران بالقرب من اللهب ، دون خلط. جهاز طرد مركزي لمدة 30 دقيقة بمعدل 470 مرة جم بدون فرملة. من الأهمية بمكان عدم خلط مرحلة الدم مع درجة الكثافة في المحلول.

بعد خطوة الطرد المركزي بالإضافة إلى الخلايا أحادية النواة ، يجب إزالتها بعناية لتجنب التلوث أو التنشيط غير المحدد للخلايا. قم بإزالة الخلايا أحادية النواة وطبقة البلازما الصفراء. انقل الخلية متعددة الأشكال النووية ، أو مرحلة PMN ، إلى أنبوب جديد سعة 50 مل ، واملأها حتى 50 مل بمحلول ملحي مخزن 1X من الفوسفات.

الطرد المركزي العينة لمدة 10 دقائق بمعدل 470 مرة مع الكبح. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 5 مل من الماء المعقم لمدة خمس ثوان لتحلل كريات الدم الحمراء. املأ الأنبوب على الفور حتى 50 مل ب 1X PBS وقم بالطرد المركزي للعينة.

عند إزالة المادة الطافية ، يجب أن تكون الحبيبات بيضاء. إذا كان لا يزال أحمر ، كرر هذه الخطوات. ثم أعد تعليق الحبيبات في 1000 ميكرولتر من معهد روزويل بارك التذكاري ، أو وسط RPMI.

احسب رقم الخلية باستخدام تلطيخ Trypan Blue ومقياس كثافة الدم تحت المجهر الضوئي. قم بإعداد معلق الخلية في RPMI بتركيز مليوني خلية لكل مل. يمكن حصاد ما يقرب من 25 مليون عدلة من 20 مل من الدم.

لعلاج العدلات دوائيا لتحليل الدهون ، استخدم 15 مليون من الخلايا المحضرة. احتضان العينات في أنابيب التفاعل لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد الطرد المركزي للعينات ، قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 300 ميكرولتر من HBSS.

بعد الطرد المركزي للعينة مرة أخرى باستخدام نفس المعلمات ، أعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من محلول الكلوروفورم: الميثانول 1: 1. ثم قم بتجانس الحبيبات المعاد تعليقها باستخدام قنة قياس 26 عن طريق دفع العينة داخل وخارج حقنة 1 مل 10 مرات. لعزل الدهون عن العدلات المشتقة من الدم المحيطي البشري ، خذ العدلات المحضرة وضعها على الجليد.

قم بضرب العدلات في أنبوب زجاجي بغطاء لولبي سعة 15 مل مع ختم PTFE ، وقم بتجانسها عن طريق رجها لمدة دقيقة واحدة. ثم أضف 2 مل من الميثانول متبوعا بعد دقيقة واحدة ب 1 مل من الكلوروفورم. بعد الاهتزاز لمدة دقيقة أخرى ، قم بتدوير الأنابيب الزجاجية في درجة حرارة الغرفة و 50 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بتكبيل جزء البروتين عن طريق الطرد المركزي للمحلول عند 7 درجات مئوية و 1 ، 952 مرة جم لمدة 10 دقائق. صب المادة الطافية بعناية في أنبوب زجاجي جديد سعة 15 مل ، تاركا الحبيبات المحتوية على البروتين وراءها. قم بتخزين الحبيبات عند 20 درجة مئوية لتقديرها الكمي في المستقبل.

أضف 1 مل من الكلوروفورم وانتظر دقيقة واحدة. ثم أضف 1 مل من الماء المقطر المزدوج واقلب أنبوب الغطاء اللولبي الزجاجي مع العينة لمدة 30 ثانية. بعد الطرد المركزي للعينة كما كان من قبل ، قم بإزالة المرحلة العليا وتجاهلها وصولا إلى الطبقة الغائمة ، ولكن ليس بما في ذلك.

جفف العينات في مكثف مفرغ عند 60 درجة مئوية وقم بتخزينها عند 20 درجة مئوية لحين الحاجة. للبدء ، املأ ما يصل إلى 5 مل من كل محلول في الغرفة الزجاجية المقابلة. أضف أي نوع من ورق الترشيح لزيادة سرعة التشغيل في كل غرفة.

باحتضان صفيحة زجاجية HPTLC هلام السيليكا 60 مقاس 20 × 10 سم مسبقا في أول حل تشغيل. بمجرد أن يصل محلول التشغيل إلى أعلى اللوحة ، جففه لمدة 10 دقائق عند 110 درجة مئوية. قم بإذابة الحبيبات الدهنية ، التي تم الحصول عليها مسبقا بعد التجفيف باستخدام مكثف فراغ ، بالحجم المطلوب من محلول الكلوروفورم: الميثانول 1: 1 ، واحتضانها لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية لتذوب.

بعد ذلك ، استخدم مسطرة وقلم رصاص ناعم لتحديد نقاط التحميل للعدد المطلوب من العينات بالإضافة إلى معيار واحد على الأقل. حدد مسافة الجري عند حوالي 4 سم لحل التشغيل الأول وحوالي 6 سم لحل التشغيل الثاني. لتحميل العينات ، اغسل حقنة 10 ميكرولتر ثلاث مرات في 1: 1 كلوروفورم: ميثانول قبل تحميل كل عينة جديدة.

قم بتحميل 10 ميكرولترات من كل عينة من حيث السقوط في محاولة لتركيز العينة على مساحة صغيرة قدر الإمكان. ضع اللوحة عموديا في الغرفة الأولى مع حل التشغيل الأول. تأكد من أن اللوحة موازية لجدار الغرفة الزجاجية لتحقيق سرعة ترحيل موحدة.

احرص على وضع الألواح بالتوازي مع الجدار الخلفي للغرف الزجاجية وأن جبهات المذيبات لا تعمل بعيدا جدا لضمان فصل الدهون بكفاءة. بمجرد وصول خط المذيب إلى العلامة الأولى ، قم بإزالة اللوحة وجففها وضعها في المحلول الثاني. كرر خطوات مماثلة للحلول الثانية والثالثة.

اترك اللوحة في المحلول حتى تصل مقدمة المذيب إلى أعلى اللوحة. ثم قم بإزالة الطبق وجففه في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة واحدة. ضع اللوحة في محلول كبريتات النحاس لمدة سبع ثوان.

بعد تجفيف الطبق جيدا ، اخبزيه في فرن لمدة سبع دقائق عند 170 درجة مئوية. أخرجي الطبق من الفرن واتركيه ليبرد. لأداء HPLC ، قم بتوصيل العمود بخرطوشة واقية على الجهاز ، وقم بتسخينه إلى 32 درجة مئوية.

استخدم الميثانول كمرحلة متنقلة بمعدل تدفق 1 مل في الدقيقة و 65 بار. اضبط كاشف الأشعة فوق البنفسجية على القياس عند 202 نانومتر لتحديد كمية الكوليسترول في كل عينة. اغسل آلة HPLC جيدا قبل تحليل العينات وقم بإنشاء منحنى قياسي للكوليسترول كما هو موضح في بروتوكول النص.

أخيرا ، أعد تعليق العينات في 500 ميكرولتر من الكلوروفورم 1: 1: الميثانول في زجاجات زجاجية بلون العنبر سعة 1.5 مل مع أغطية لولبية حمراء PTFE / أغطية سيليكون بيضاء قبل تحميلها على أداة HPLC. يظهر هنا المظهر الجانبي للدهون للعدلات على لوحة HPTLC. يمكن تحديد الدهون من خلال مقارنة مسافات الهجرة بالمعيار.

يظهر أيضا مخطط كروماتوغرام HPLC يظهر قمتين كبيرتين. الذروة الأولى قبل دقيقتين بقليل هي الكلوروفورم. الذروة الكبيرة الثانية في خمس دقائق هي الكوليسترول.

تظهر هنا منحنيات قياسية للكوليسترول تحددها HPLC و HPTLC. المنحنى القياسي الذي تم الحصول عليه بواسطة HPLC خطي على نطاق تركيز أوسع مقارنة بالمنحنى القياسي HPTLC. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل العدلات المشتقة من الدم البشري ثم تحليل تركيبتها الدهنية.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر ارتداء قفازات النتريل لحماية يديك من الكلوروفورم الخطير: التعرض للميثانول وأيضا للعمل تحت غطاء الدخان. ستوفر التجارب المستقبلية مزيدا من المعلومات حول الآليات التي ينطوي عليها تكوين NET ووظائف العدلات العامة التي لا تزال غير مفهومة تماما. لا تنس أن العمل مع الخلايا الأولية المشتقة من الدم البشري يتطلب إذنا أخلاقيا بالإضافة إلى احتياطات السلامة المناسبة مثل العمل في مختبر السلامة الحيوية المعني لتجنب التعرض لمخاطر مسببات الأمراض البشرية.

أخيرا ، الهدف من دراستنا هو إيجاد أهداف علاجية جديدة ضد العدوى القائمة على الجهاز المناعي الفطري ، وخاصة تكوين الدهون مثير للاهتمام للغاية بالنسبة لنا لأنه سيساعدنا على فهم سبب تأثير العدلات على مضادات الميكروبات ضد العدوى.