التصور من الفحم آجار ريسازورين الفحص لشبه الكمي، متوسطة الإنتاجية تعداد مايكوباكتيريا

الهدف العام من اختبار CARA هو توفير تقييم شبه كمي متوسط الإنتاجية لنشاط المركبات ضد الميكوبكتيريا المكررة وغير المكررة. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أنها، كبديل لعد الوحدات المكونة للمستعمرات (CFU)، تسمح باختبار سريع لمدى اعتماد المركب على الجرعة والوقت. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال اكتشاف أدوية السل، مثل تحديد ما إذا كان المركب مثبطاً للبكتيريا (bacteriostatic) أو قاتلاً لها (bactericidal) ضد البكتيريا المكررة، وما إذا كان قاتلاً للبكتيريا ضد البكتيريا غير المكررة.

ستقوم جوليا روبرتس، زميلة في مختبرنا، بعرض هذه الطريقة. أضف 450 milliliters من الماء إلى دورق زجاجي سعة لتر واحد، أو 900 milliliters من الماء إلى دورق إرلنماير سعة لترين. ضع قضيب تقليب قابل للتعقيم بالأتوكلاف في الدورق أو القارورة.

بعد ذلك، أضف مسحوق Middlebrook 7H11، وفحمًا نشطًا ليصل التركيز النهائي إلى 0.4%، ومحلول glycerol بتركيز 50% للوصول إلى تركيز نهائي قدره 0.2%. قم بتغطية فتحة الدورق أو الكأس بورق ألومنيوم وثبتها على الزجاج باستخدام شريط التعقيم (autoclave tape). بعد تعقيم الوسط في الموصدة، برده حتى تصل درجة حرارته إلى ما يقرب من 55 إلى 65 درجة Celsius على لوح تحريك مغناطيسي مضبوط على سرعة منخفضة للحفاظ على الفحم في حالة تعليق.

أثناء العمل بطريقة معقمة داخل غطاء السلامة البيولوجية المزود بلوح تحريك مغناطيسي، قم بإزالة الرقاقة من الوسط وأضف 100 أو 50 ملليلتر من مكمل OADC إلى دورق سعة لترين أو بيكر سعة لتر واحد على التوالي مع الاستمرار في الخلط. باستخدام ماصة متعددة القنوات ذات ثمانية أو 12 طرف تصفية، املأ لوح ميكروي ذو 96 بئرًا بـ 200 ميكرولتر من 7H11-OADC-charcoal لكل بئر من خزان الكاشف أو البيكر، مع العمل بسرعة لتجنب تصلب الآغار وتكون الفقاعات. ضع مجموعات ألواح CARA الميكروية في أكياس بلاستيكية قابلة لإعادة الغلق لتجنب الجفاف، واحفظها في درجة حرارة أربع درجات مئوية.

قم بتلقيح أنابيب طرد مركزي ذات قاع مستدير أو مخروطي مصنوعة من البولي بروبيلين، تحتوي على 4 أو 20 مللي لتر على التوالي من وسط Middlebrook 7H9-ADN أو 7H9-OADC، ببكتيريا M.smegmatis بكثافة ضوئية OD580 تتراوح بين 0.01 و 0.1. حضّن مزارع M.smegmatis عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و 20%O2 مع الرج، حتى تصل المزارع إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي المتوسط أو كثافة ضوئية OD580 تقريبية تبلغ 0.5. لإعداد تجربة على نمط التركيز المثبط الأدنى في ظل ظروف التكاثر وعدم التكاثر، وزع 200 ميكرولتر من الخلايا في وسط 7H9-ADN بكثافة ضوئية OD580 تبلغ 0.01 في جميع آبار لوحة ذات 96 بئراً، ذات قاع شفاف ومعالجة لزراعة الأنسجة.

بالنسبة لمقايسة الخلايا غير المتضاعفة، استخدم PBS يحتوي على 0.02% tyloxapol لغسل الخلايا مرتين. ثم استخدم وسطاً غير متضاعف لإعادة تعليق الخلايا. استخدم الوسط غير المتضاعف لتخفيف الخلايا حتى تصل قيمة OD580 إلى 0.1، وأضف نترات الصوديوم بتركيز نهائي يتراوح من 0.5 إلى 5 millimolar من محلول مخزون بتركيز one molar تم تحضيره حديثاً.

وزع 200 µL من الخلايا بكثافة ضوئية OD580 تبلغ 0.1 في جميع آبار لوحة زراعة أنسجة ذات 96 بئر وقاعدة شفافة. بعد تحضير عوامل الاختبار وفقاً للبروتوكول المكتوب، أضف 2 µL من عامل الاختبار الأول في الصفوف من A إلى E، و 2 µL من عامل الاختبار الثاني في الصفوف من E إلى H، ثم اخلط جيداً. بالنسبة للمقاييس المكررة، يتم تحضين ألواح M.smegmatis الصغيرة عند 37 °C، و 20%O2 و 5%CO2 لمدة تتراوح من ساعة واحدة إلى 48 ساعة.

عند النقاط الزمنية التي سيُستخدم فيها اختبار CARA كقراءة للنتائج، استخدم ماصة متعددة القنوات p200 مضبوطة على 50 إلى 75 µL لإعادة تعليق محتويات آبار لوحة مقايسة MIC90 بعناية عن طريق السحب والدفع بالماصة من خمس إلى 10 مرات. ثم استخدم رؤوس الماصة لتحريك محتويات الآبار بلطف في حركة دائرية. انقل 10 µL من محتويات بئر المقايسة غير المخففة إلى الآبار المقابلة في لوحة CARA الدقيقة مع تجنب تطاير السوائل أثناء النقل، وضمان وضع حصة الـ 10 µL في منتصف آبار لوحة CARA الدقيقة.

باستخدام شريط تثبيت الأطباق، اربط مجموعات أطباق CARA الدقيقة ثم ضعها في كيس بلاستيكي قابل لإعادة الغلق. قم بحضن أطباق CARA الدقيقة التي تحتوي على M.smegmatis عند 37 درجة مئوية مع 20%O2 لمدة تتراوح من يوم إلى يومين للأطباق المكررة ومن يومين إلى ثلاثة أيام للأطباق غير المكررة. عندما تظهر غشاء من النمو البكتيري أو مستعمرات عينية أكبر في آبار الضابط السلبي، استخدم مجموعة واحدة مكونة من 12 طرف p200 مع ماصة متعددة القنوات لتوزيع 40 microliters من PBS المعقم على طول جانب الآبار واترك PBS يتوزع فوق سطح الآجار/المستعمرات البكتيرية الدقيقة.

قم بتحضير كاشف تطوير CARA عن طريق خلط 5 mg من resazurin و50 mL من Tween80 بتركيز 5% في PBS. أضف 50 µL من كاشف تطوير CARA المُحضّر حديثاً إلى كل بئر من آبار لوحة CARA الدقيقة. بعد ذلك، قم بهز الألواح ذهاباً وإياباً عدة مرات للمساعدة في توزيع الكاشف عبر الآجار والحصيرة البكتيرية في كل بئر.

ضع الأطباق في كيس بلاستيكي قابل للإغلاق وحضنها عند 37 °C لمدة 30 دقيقة على الأقل لبكتيريا M.smegmatis. وقبل قياس الفلورة، ضع أطباق CARA الدقيقة في غطاء السلامة البيولوجية لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع إزالة الأغطية. عند استخدام أجهزة قياس الطيف الضوئي من المستوى BSL3 خارج كابينة السلامة البيولوجية، قم بلصق ملصق PCR بجودة بصرية فوق الطبق واستخدم منشفة ورقية ناعمة للإغلاق بإحكام عن طريق الضغط بلطف على سطح الملصق.

حدد الفلورية عبر القراءة العلوية مع استثارة عند 530 nanometers وانبعاث عند 590 nanometers. ليس من الضروري تصفير الطبق. لتحليل البيانات، قم برسم تركيز المثبط على محور X بمقياس log10 والفلورية على محور Y بمقياس خطي.

يرجى الرجوع إلى البروتوكول النصي للحصول على تفاصيل إضافية. إن تركيز العامل المختبر الذي يؤدي إلى فشل فلورة CARA في الارتفاع فوق مستويات الخلفية هو CARA-MBC ≥ 99 الموضح هنا. يشير الرمز السفلي ≥ 99 إلى أن CARA-MBC يوفر تركيزاً تقديرياً للعامل المختبر يؤدي إلى قتل بكتيري أكبر من أو يساوي 2 log10.

يُشتبه في أن المركبات تُحدث تأثيراً مضاداً للمضادات الحيوية إذا أظهرت نافذة استاتيكية، والتي تُعرّف بأنها إزاحة نحو اليمين تزيد عن أربعة أضعاف بين منحنيات MIC و CARA. وتشير النافذة الاستاتيكية إلى أن الجزيء النشط ضد بكتيريا M.tuberculosis المتضاعفة قد يكون مثبطاً للبكتيريا بدلاً من أن يكون قاتلاً لها. وبالنسبة للجزيئات ذات التأثير القوي المضاد للمضادات الحيوية، قد يصعب ملاحظة النوافذ الاستاتيكية، ولا تظهر إلا بعد فحص محور Y الموسع لفلورة CARA كما هو موضح هنا.

تظهر هنا الجزيئات النشطة المتضاعفة وغير المتضاعفة التي تم اختبارها بواسطة MIC90 وCARA. وبينما يبدو أن isoniazid وlinezolid يمتلكان نشاطاً ضد البكتيريا غير المتضاعفة وفقاً لمقايسة MIC90، إلا أن CARA تشير إلى أنها غير نشطة في ظل ظروف عدم التضاعف التي تم اختبارها. وفي تجربة CARA هذه، كشف تعريض M.smegmatis لتركيزات متزايدة من rifampicin عن وجود تأثير في غضون ساعة واحدة فقط، وأظهر نشاطاً مبيداً للبكتيريا يتزايد بين 3 و24 ساعة، حيث تسبب في قتل ما يعادل أو يزيد عن 2 إلى 3 log10 عند تركيز 10 micrograms per milliliter تقريباً بحلول الساعة 24.

بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون ساعتين تقريباً لتحضير الأطباق، وأقل من ساعة لنقل الخلايا إلى أطباق CARA، ومن ساعة إلى ساعتين تقريباً لتحميض وقياس الفلورة لأطباق CARA إذا نُفذت بشكل صحيح. وأثناء محاولة تطبيق هذا الإجراء، من المهم تذكر استخدام CARA كاختبار تنبؤي لتحديد ما إذا كان المركب يتمتع بنشاط مبيد للبكتيريا (bactericidal) أو مثبط للبكتيريا (bacteriostatic) ضد المتفطرات (mycobacteria) سواء كانت في حالة تضاعف أو غير متضاعفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد CARA وتحليل البيانات بطريقة تساعد في التنبؤ بنوع نشاط المركب.

شكراً للمشاهدة، مع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.