التصور من الفحم آجار ريسازورين الفحص لشبه الكمي، متوسطة الإنتاجية تعداد مايكوباكتيريا

الهدف العام ل CARA هو توفير تقييم شبه كمي متوسط الإنتاجية لنشاط المركبات ضد البكتيريا الفطرية المتكاثرة وغير المتكاثرة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه بصفتها بديلا ل CFU ، تسمح CARA للمرء باختبار الجرعة والوقت بسرعة من الاعتماد على المركب. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال اكتشاف أدوية السل مثل تحديد ما إذا كان المركب مضادا للجراثيم أو مبيدا للجراثيم ضد البكتيريا المتكاثرة وما إذا كان مبيدا للجراثيم ضد البكتيريا غير المتكاثرة.

ستظهر هذه الطريقة جوليا روبرتس ، وهي زميلة في مختبرنا. أضف 450 مل من الماء إلى دورق زجاجي سعة لتر واحد أو 900 مل من الماء إلى قارورة Erlenmeyer سعة لترين. قم بتضمين قضيب تقليب قابل للتعقيم في الدورق أو القارورة.

بعد ذلك ، أضف مسحوق Middlebrook 7H11 والفحم المنشط إلى تركيز نهائي بنسبة 0.4٪ ومحلول جلسرين 50٪ لتحقيق تركيز نهائي بنسبة 0.2٪. قم بتغطية فتحة القارورة أو الدورق بورق الألمنيوم وقم بتثبيتها بالزجاج بشريط الأوتوكلاف. بعد تعقيم الوسط ، قم بتبريده إلى حوالي 55 إلى 65 درجة مئوية على لوحة تحريك مغناطيسية مضبوطة على سرعة منخفضة للحفاظ على الفحم في حالة تعليق.

أثناء العمل بشكل معقم في شفاط السلامة الحيوية الذي يحتوي على لوحة تحريك مغناطيسية ، قم بإزالة الرقاقة من الوسط وأضف 100 أو 50 مل من مكمل OADC إلى قارورة سعة لترين أو دورق لتر واحد على التوالي واستمر في الخلط. باستخدام ماصة متعددة القنوات بثمانية أو 12 طرف مرشح، املأ صفيحة دقيقة سعة 96 بئرا ببئر 200 ميكرولتر من فحم 7H11-OADC من خزان الكاشف أو الدورق ، وتعمل بسرعة لتجنب تصلب الأجار وتكوين الفقاعات. ضع أكواما من ألواح CARA الدقيقة في أكياس بلاستيكية قابلة لإعادة الإغلاق لتجنب الجفاف وتخزينها عند أربع درجات مئوية.

تلقيح أنابيب الطرد المركزي المستديرة القاع أو المخروطية البولي بروبلين التي تحتوي على أربعة أو 20 ملليلتر على التوالي من Middlebrook 7H9-ADN أو 7H9-OADC مع M.smegmatis عند OD580 من 0.01 إلى 0.1. احتضان مزارع M.smegmatis عند 37 درجة مئوية و 20٪ O2 مع الاهتزاز ، وتوسيع الثقافات إلى منتصف مرحلة السجل أو OD580 التقريبي 0.5. لإعداد الحد الأدنى من تجربة نمط التركيز المثبط في ظل ظروف التكرار وغير التكرار ، قم بتوزيع 200 ميكرولتر من الخلايا في 7H9-ADN عند OD580 من 0.01 في جميع آبار صفيحة ثقافة الأنسجة المعالجة ذات القاع الشفاف 96 بئر.

بالنسبة للمقايسة غير المتماثلة ، استخدم PBS الذي يحتوي على 0.02٪ tyloxapol لغسل الخلايا مرتين. واستخدم وسيطا غير مكرر لإعادة تعليق الخلايا. استخدم وسيطا غير متكاثر لتخفيف الخلايا إلى OD580 من 0.1 وأضف نترات الصوديوم إلى تركيز نهائي من 0.5 إلى 5 مللي مولار من مخزون مولي واحد طازج.

قم بتوزيع 200 ميكرولتر من الخلايا بمعدل OD580 من 0.1 في جميع آبار صفيحة ثقافة الأنسجة ذات القاع الشفاف والمعالجة بسعة 96 بئرا. بعد تحضير عوامل الاختبار وفقا لبروتوكول النص ، أضف ميكرولترين من عامل الاختبار أحدهما في الصفوف من A إلى E وميكرولترين من عامل الاختبار اثنين في الصفوف من E إلى H ، واخلطهم جيدا. لتكرار المقايسات ، احتضان الصفائح الدقيقة M.smegmatis عند 37 درجة مئوية و 20٪ O2 و 5٪ CO2 لمدة ساعة إلى 48 ساعة.

في النقاط الزمنية التي سيتم فيها استخدام CARA كقراءة، استخدم ماصة p200 متعددة القنوات مضبوطة من 50 إلى 75 ميكرولترا لإعادة تعليق محتويات البئر في لوحة الفحص على غرار MIC90 بعناية عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل من خمس إلى 10 مرات. ثم استخدم أطراف الماصة لتحريك محتويات الآبار برفق بحركة دائرية. انقل 10 ميكرولترات من محتويات بئر الفحص غير المخفف إلى الآبار المقابلة لصفيحة CARA الدقيقة لتجنب الرش أثناء عمليات النقل ، مما يضمن أن يتم رصد 10 ميكرولتر في منتصف آبار الصفيحة الدقيقة CARA.

باستخدام شريط اللوحة ، اربط أكوام من ألواح CARA الدقيقة ثم ضعها في كيس بلاستيكي قابل لإعادة الإغلاق. احتضان الصفائح الدقيقة M.smegmatis CARA عند 37 درجة مئوية مع 20٪ O2 لمدة يوم إلى يومين لتكرار الألواح ولمدة يومين إلى ثلاثة أيام للألواح غير المتماثلة. عندما يكون فيلم النمو البكتيري أو المستعمرات العيانية الأكبر مرئيا في آبار التحكم السلبية ، استخدم مجموعة واحدة من 12 طرف p200 مع ماصة متعددة القنوات لتوزيع 40 ميكرولترا من PBS المعقم على طول جانب الآبار والسماح ل PBS بالتوزيع عبر الجزء العلوي من المستعمرات الدقيقة الأجار / البكتيرية.

قم بإعداد كاشف تطوير CARA عن طريق خلط خمسة ملليغرام من الريزازورين و 50 مل من 5٪ Tween80 في PBS. أضف 50 ميكرولترا من كاشف CARA المحضر حديثا إلى كل بئر من صفيحة CARA. ثم قم بهز الصفائح ذهابا وإيابا عدة مرات للمساعدة في توزيع الكاشف عبر الأجار والحصيرة البكتيرية في كل بئر.

ضع الألواح في كيس بلاستيكي قابل لإعادة الإغلاق واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل ل M.smegmatis. قبل قراءة التألق ، ضع ألواح CARA الدقيقة في شفاط السلامة الحيوية لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع إزالة الأغطية. عند استخدام مقاييس الطيف الضوئي BSL3 خارج خزانة السلامة الحيوية ، قم بلصق ملصق PCR بجودة بصرية فوق اللوحة واستخدم منشفة ورقية ناعمة لإغلاقها بإحكام عن طريق الضغط برفق على سطح الملصق.

حدد التألق عبر القراءة العلوية مع الإثارة عند 530 نانومتر والانبعاث عند 590 نانومتر. ليس من الضروري إفراغ اللوحة. لتحليل البيانات ، ارسم تركيز المثبط على المحور X كمقياس log10 والتألق على المحور Y على مقياس خطي.

راجع بروتوكول النص للحصول على تفاصيل إضافية. تركيز عامل الاختبار الذي ينتج عنه فشل مضان CARA في الارتفاع فوق مستويات الخلفية هو CARA-MBC أكبر من 99 كما هو موضح هنا. يشير الأكبر من يساوي 99 إلى أن CARA-MBC يوفر تركيزا تقديريا لعامل الاختبار ، مما يؤدي إلى قتل بكتيري أكبر من يساوي اثنين من log10.

يشتبه في أن المركبات تمارس تأثيرا بعد المضادات الحيوية إذا عرضت نافذة ثابتة ، تعرف على أنها تحول أكبر من أربعة أضعاف إلى اليمين بين منحنيات MIC و CARA. تشير النافذة الثابتة إلى أن الجزيء النشط ضد تكاثر مرض السل المكثر قد يكون مضاد للجراثيم بدلا من مبيد للجراثيم. بالنسبة للجزيئات ذات التأثير القوي بعد المضادات الحيوية ، قد يكون من الصعب ملاحظة النوافذ الثابتة ولا تظهر إلا بعد فحص المحور Y الموسع لتألق CARA كما هو موضح هنا.

عرض الجزيئات النشطة المتماثلة وغير المتماثلة التي تم اختبارها بواسطة MIC90 و CARA هنا. بينما يبدو أن الأيزونيازيد واللينزوليد لهما نشاط ضد البكتيريا غير المتكاثرة بواسطة مقايسة MIC90 ، تشير CARA إلى أنهما غير نشطين في ظل ظروف عدم التكاثر التي تم اختبارها. في تجربة CARA هذه ، كشف تعريض M.smegmatis لتركيزات متزايدة من الريفامبيسين عن تأثير في أقل من ساعة واحدة وأظهر نشاطا متزايدا في مبيد للجراثيم بين ثلاث و 24 ساعة مما أدى إلى قتل أكبر من اثنين إلى ثلاثة log10 بحوالي 10 ميكروغرام لكل مليلتر بحلول 24 ساعة.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ساعتين تقريبا لإعداد الألواح ، وأقل من ساعة لنقل الخلايا إلى ألواح CARA ، وحوالي ساعة إلى ساعتين لتطوير وقياس تألق ألواح CARA إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام CARA كمقايسة تنبؤية لتحديد ما إذا كان المركب يحتوي على نشاط مبيد للجراثيم أو مضاد للجراثيم ضد البكتيريا الفطرية التي تتكاثر أو لا تتكاثر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد CARA وتحليل البيانات بطريقة تساعد في التنبؤ بنوع نشاط المركب.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.