اضطرابات في الدورة الدموية miRNAs في متلازمة القولون العصبي التي تم اكتشافها باستخدام تعدد الإنتاجية العالية منصة التعبير الجيني

الهدف العام من بروتوكول القياس الكمي للحمض النووي متعدد الإرسال هذا هو تحديد تعبير الحمض النووي الريبي الصغير رقميا في الدم الكامل. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في دراسة اضطرابات الجهاز الهضمي. يساعد في تحديد الآليات الجزيئية غير المنظمة وتوقيعات المؤشرات الحيوية ، مثل microRNAs.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن القياس الكمي للحمض النووي الريبي الصغير لا يعتمد على التضخيم. تحسب هذه التقنية الأهداف الجزيئية رقميا وهي مؤتمتة إلى حد كبير. لتنقية الحمض النووي الريبي الكلي ، قم بإذابة واحتضان عينات الدم الكاملة التي تم جمعها وتجميدها مسبقا لمدة ساعتين.

استخدم دوار دلو متأرجح لطرد الأنابيب عند 5 ، 000 مرة جم في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة المواد الطافية عن طريق سكبها بعناية أو ماصتها في أنبوب نفايات ، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات. أضف أربعة ملليلتر من الماء الخالي من RNase إلى الحبيبات.

استبدل الغطاء بإحكام, والدوامة حتى تذوب الحبيبات بشكل واضح. ثم ، قم بالطرد المركزي للأنبوب مرة أخرى ، وقم بإزالة المادة الطافية. بعد ذلك ، أضف 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت BM1 إلى الحبيبات والدوامة حتى تذوب الحبيبات بشكل واضح.

بعد ذلك ، انقل العينة إلى أنبوب معالجة ملليلتر لاستخراج الحمض النووي الريبي الكلي الآلي. باستخدام مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي الريبي المتوفرة تجاريا ، قم بإجراء تنقية آلية للحمض النووي الريبي داخل الخلايا ، بما في ذلك الحمض النووي الريبي الصغير من عينة الدم الكاملة ، عن طريق تحميل أطراف الماصة المحملة مسبقا ، وأنابيب الطرد المركزي ، والمخازن المؤقتة ، والكواشف المتوفرة في مجموعة تنقية الحمض النووي الريبي في نظام استخراج الحمض النووي الريبي الآلي. من قائمة تحديد البروتوكولات ، اختر بروتوكول Blood miRNA PartA ، وابدأ التشغيل.

أكمل استخراج الحمض النووي الريبي ، وقم بتخزين العينات وفقا لبروتوكول النص. قم بإعداد عينات microRNA أولا باستخدام الماء الخالي من RNase لتطبيع 12 عينة من الحمض النووي الريبي إلى 33 نانوغرام لكل ميكرولتر. باستخدام الماء الخالي من النوكلياز ، قم بإعداد تخفيف 1 في 500 من عناصر التحكم في microRNA المتوفرة في مجموعة الفحص ، واستمر في وضع الجليد.

بعد ذلك ، قم بإعداد مزيج التلدين الرئيسي عن طريق الجمع بين 13 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتلدين ، و 26 ميكرولترا من كاشف علامة R الدقيقة ، و 6.5 ميكرولتر من أدوات التحكم في microRNA. إلى كل أنبوب شريطي سعة 12 0.2 ملليلتر ، أضف 3.5 ميكرولتر من مزيج التلدين الرئيسي ، ثم أضف 3 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي. قم بتحريك الأنابيب للخلط ، وقم بتدويرها بمعدل 2000 مرة جم باستخدام جهاز طرد مركزي صغير على سطح الطاولة ، وقم بتشغيل الأنابيب في جهاز تدوير حراري باستخدام البرنامج التالي.

بعد ذلك ، قم بإعداد مزيج رئيسي للربط عن طريق الجمع بين ثلاثة ميكرولترات من مخزن الربط المؤقت و 19.5 ميكرولتر من PEG. ثم أضف 2.5 ميكرولتر من مزيج الربط الرئيسي إلى كل تفاعل. بعد خلط الأنابيب وتدويرها ، أعدها إلى جهاز التدوير الحراري عند 48 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

ثم أضف ميكرولتر واحد من الليغاز مباشرة إلى كل عينة بينما لا يزال في كتلة التدوير الحراري ، واحتضان الأنابيب باستخدام البرنامج التالي. امزج الأنابيب برفق وقم بتدويرها ، وأضف ميكرولتر واحد من إنزيم تنظيف الربط إلى كل عينة. بعد ذلك ، قم باحتضان الأنابيب في جهاز التدوير الحراري كما هو موضح هنا.

بعد الحضانة ، أضف 40 ميكرولترا من الماء الخالي من RNase إلى العينات قبل خلطها وتدويرها. لإجراء تهجين microRNA ، قم بإذابة المراسل والتقط مجموعات المسبار المتوفرة على الجليد ، وقم بتدويرها. أضف 130 ميكرولترا من المخزن المؤقت للتهجين إلى مجموعة أكواد المراسل 2، واخلطها لإنشاء مزيج التهجين الرئيسي.

في 12 أنبوبا شريطيا جديدا سعة 0.2 مليلتر ، أضف 20 ميكرولترا من مزيج التهجين الرئيسي. قم بتغيير طبيعة عينات الحمض النووي الريبي الميكروي المحضرة للتو عند 85 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، وقم بتبريدها على الجليد. بعد ذلك ، أضف 5 ميكرولترات من عينات microRNA إلى كل أنبوب من أنابيب الشريط التي تحتوي على مزيج التهجين الرئيسي.

قم ببرمجة جهاز التدوير الحراري إلى 65 درجة مئوية ، عند درجة حرارة محسوبة بالحجم 30 ميكرولتر ، والغطاء الساخن في إعداد وقت Forever بحيث لا ينخفض إلى 4 درجات مئوية في نهاية التشغيل. أضف 5 ميكرولترات من مسبار الالتقاط الذي تم ضبطه على كل أنبوب ، واخلطه. ثم ، بعد تدويرها لأسفل ، ضع الأنابيب على الفور في جهاز التدوير الحراري عند 65 درجة مئوية.

احتضان العينات لمدة لا تقل عن 12 ساعة ولا تزيد عن 30 ساعة. قم بإعداد محطة الإعداد عن طريق تسخين الخرطوشة والألواح أولا إلى درجة حرارة الغرفة. ثم قم بتدوير اللوحات.

لتحميل محطة الإعداد ، افتح باب المحطة ، وقم بتحميل ألواح الكاشف ، والخرطوشة ، وأطراف الماصة ، والعينات المحضرة في أنابيب شريطية سعة 0.2 مليلتر ، وأنبوبين شريطيين فارغين سعة 0.2 مليلتر من 12 أنبوبا إلى المواقع المناسبة في الروبوت. قم بإزالة أغطية أنبوب الشريط وغطاء لوحة الكاشف. بعد ذلك ، أغلق باب محطة الإعداد ، وقم بتشغيل الفحص المناسب من لوحة التحكم.

لتصور وحساب الرموز الشريطية للمجمعات الثلاثية المجمدة والموجهة ، قم بإزالة الخرطوشة من محطة الإعداد ، واستخدم الغطاء المقدم لإغلاقها ، وضعها في المحلل الرقمي في أي فتحة متاحة. استخدم شاشة اللمس لإنشاء ملف تعريف خرطوشة أو CDF. تأكد من تعيين ملف مكتبة المراسل المناسب لكل عينة في CDF.

بمجرد اكتمال المسح ، قم بتنزيل ملفات البيانات من المحلل الرقمي باستخدام محرك أقراص USB أو عبر البريد الإلكتروني ، قبل معالجة البيانات وتحليلها ، وفقا لمراقبة الجودة وبروتوكول التحليل المرتبط. يقلل نظام فحص منصة التعبير الجيني من الضوضاء التقنية من خلال طبيعته المؤتمتة للغاية ، وتنتج الكيمياء الفريدة التي يستخدمها بيانات تعبير جيني عالية الدقة. توضح التكرارات التقنية الموضحة هنا قابلية التكرار العالية في كل من القياس الكمي لتعبير الحمض النووي الريبي الميكرو الداخلي والفيروسي الممكن.

باستخدام هذه الطريقة ، يمكن تحديد الحمض النووي الريبي الصغير البشري المشفر فيروسيا والذاتي الذي يظهر انحرافا عن التعبير المتوقع ، كما هو محدد من قبل المشاركين الأصحاء في الدراسة ، كأهداف ذات أهمية في القولون العصبي. تسمح دقة وحساسية الطريقة باكتشاف الاضطرابات بين الأهداف منخفضة التعبير ، ويمكن أيضا ملاحظة الاضطرابات الدقيقة بشكل موثوق. توضح هذه الأرقام بعض الاضطرابات في الحمض النووي الريبي الصغير المنتشرة في القولون العصبي ، والأنواع الفرعية من القولون العصبي ، مقارنة بالضوابط الصحية.

تقديم أهم اثنين من الحمض النووي الريبي الصغير المرتفع تفاضليا في المشاركين في القولون العصبي هنا. تشير المنحنيات الموجودة في مخطط الكمان هذا إلى تكرار التهم ل miR-150. تمثل الأشرطة الرأسية الربعين الأول والثالث ويشير المربع الأحمر إلى متوسط العدد.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء فحوصات مخصصة أكثر استهدافا بناء على نفس التكنولوجيا من أجل التحقق من صحة توقيعات المؤشرات الحيوية في مجموعات أكبر واستكشاف ارتباطات الحمض النووي الريبي والبروتين الأساسية. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال البحوث الطبية الحيوية لتطوير لوحات المؤشرات الحيوية التشخيصية للأمراض بسرعة وبدقة ودقة.