اضطرابات في الدورة الدموية miRNAs في متلازمة القولون العصبي التي تم اكتشافها باستخدام تعدد الإنتاجية العالية منصة التعبير الجيني

الهدف العام من بروتوكول قياس كمية الأحماض النووية المتعددة هذا هو التحديد الكمي الرقمي للتعبير عن microRNA في الدم الكامل. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في دراسة الاضطرابات الهضمية، كما تساهم في تحديد الآليات الجزيئية المختلة وبصمات المؤشرات الحيوية، مثل microRNAs.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أن تقدير كمية الـ microRNA لا يعتمد على التضخيم. وتقوم هذه التقنية بعدد الأهداف الجزيئية رقمياً وهي مؤتمتة إلى حد كبير. ولتنقية الـ RNA الكلي، قم بإذابة عينات الدم الكامل التي تم جمعها وتجميدها مسبقاً وتحضينها لمدة ساعتين.

استخدم دوّاراً ذا دلاء متأرجحة لطرد الأنابيب مركزياً عند 5,000 ×g في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق. بعد ذلك، قم بإزالة السوائل الطافية عن طريق صبها أو سحبها بعناية باستخدام الماصة إلى أنبوب النفايات، مع الحرص على عدم تعكير الراسب. أضف أربعة ملليلتر من الماء الخالي من RNase إلى الراسب.

أغلق الغطاء بإحكام، وباستخدام جهاز هزاز vortex حتى تذوب الراسبة بشكل مرئي. بعد ذلك، قم بطرد مركزي للأنبوب مرة أخرى، وأزل السائل الطافي. ثم أضف 350 µL من BM1 buffer إلى الراسبة وقم بالرج باستخدام vortex حتى تذوب الراسبة بشكل مرئي.

بعد ذلك، انقل العينة إلى أنبوب معالجة سعة 2 mL لاستخلاص الحمض النووي الريبوزي الكلي (total RNA) آلياً. وباستخدام طقم استخلاص RNA متاح تجارياً، قم بإجراء تنقية آلية لـ RNA داخل الخلايا، بما في ذلك microRNA من عينة الدم الكامل، عن طريق تحميل رؤوس الماصات المجهزة مسبقاً، وأنابيب الطرد المركزي، والمحاليل المنظمة، والكواشف المتوفرة في طقم تنقية RNA في نظام استخلاص RNA الروبوتي. من قائمة اختيار البروتوكولات، اختر بروتوكول Blood miRNA PartA، ثم ابدأ التشغيل.

أكمل عملية استخلاص الـ RNA، ثم قم بتخزين العينات وفقاً للبروتوكول النصي. قم بتحضير عينات الـ microRNA عن طريق استخدام ماء خالٍ من الـ RNase أولاً لتوحيد تركيز 12 عينة RNA إلى 33 nanograms per microliter. وباستخدام ماء خالٍ من النيوكليز (nuclease-free water)، قم بتحضير تخفيف بنسبة 1-in-500 لضوابط الـ microRNA المرفقة في طقم المقايسة، واحفظها على الثلج.

بعد ذلك، قم بتحضير المزيج الرئيسي للتهجين عن طريق دمج 13 µL من محلول التخزين الخاص بالتهجين، و26 µL من كاشف micro R-tag، و6.5 µL من ضوابط microRNA. أضف 3.5 µL من المزيج الرئيسي للتهجين إلى كل أنبوب من أنابيب الشريط سعة 0.2 mL (عدد 12 أنبوباً)، ثم أضف 3 µL من عينة RNA. قم بنقر الأنابيب لخلط المكونات، ثم قم بتدويرها بسرعة 2000 ×g باستخدام جهاز طرد مركزي صغير مكتبي، وشغّل الأنابيب في جهاز الدورات الحرارية باستخدام البرنامج التالي.

بعد ذلك، قم بتحضير مزيج رئيسي للربط عن طريق دمج 3 µL من منظم الربط و 19.5 µL من PEG. ثم أضف 2.5 µL من المزيج الرئيسي للربط إلى كل تفاعل من التفاعلات. بعد خلط الأنابيب وطردها مركزياً، أعدها إلى جهاز التدوير الحراري عند 48 °C لمدة خمس دقائق.

ثم أضف 1 µL من إنزيم الربط (ligase) مباشرة إلى كل عينة بينما لا تزال في كتلة الدورق الحراري، وحضن الأنابيب باستخدام البرنامج التالي. اخلط الأنابيب برفق وقم بتدويرها (spin down)، ثم أضف 1 µL من إنزيم تنقية الربط (ligation cleanup enzyme) إلى كل عينة. بعد ذلك، حضن الأنابيب في الدورق الحراري كما هو موضح هنا.

بعد فترة التحضين، أضف 40 µL من الماء الخالي من RNase إلى العينات قبل خلطها وطردها مركزياً. ولإجراء تهجين microRNA، قم بإذابة مجموعات مسبار التقرير والالتقاط المتوفرة على الثلج، ثم قم بطردها مركزياً. أضف 130 µL من محلول التهجين المنظم إلى Reporter Code Set 2، واخلط المكونات لتحضير الخليط الرئيسي للتهجين.

في 12 أنبوباً جديداً من أنابيب الشرائط سعة 0.2 milliliter، أضف 20 µL من مزيج التهجين الرئيسي. قم بمسخ عينات microRNA التي تم تحضيرها للتو عند 85 °C لمدة خمس دقائق، ثم بردها على الثلج. بعد ذلك، أضف 5 µL من عينات microRNA إلى كل أنبوب من أنابيب الشرائط التي تحتوي على مزيج التهجين الرئيسي.

قم ببرمجة جهاز التدوير الحراري على درجة حرارة 65 درجة مئوية، مع ضبط درجة الحرارة بناءً على حجم 30 µL، واضبط الغطاء المسخن على إعداد Forever لضمان عدم انخفاض درجة الحرارة إلى 4 درجة مئوية في نهاية التشغيل. أضف 5 µL من مجموعة مجسات الالتقاط إلى كل أنبوب، ثم امزج المكونات. بعد ذلك، وبعد إجراء عملية الطرد المركزي لترسيب السوائل، ضع الأنابيب فوراً في جهاز التدوير الحراري عند درجة حرارة 65 درجة مئوية.

قم بتحضين العينات لمدة لا تقل عن 12 ساعة، ولا تزيد عن 30 ساعة. قم بتجهيز محطة التحضير عن طريق تدفئة الخرطوشة والأطباق أولاً حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة، ثم قم بطرد الأطباق مركزياً.

لتحميل محطة التحضير، افتح باب المحطة، وقم بتحميل أطباق الكاشف، والخرطوشة، ورؤوس الماصات، والعينات المُحضرة في أنابيب شرائط سعة 0.2 milliliter، وأنبوبين فارغين من أنابيب الشرائط سعة 0.2 milliliter التي تحتوي على 12 أنبوباً في المواقع المخصصة لها في الروبوت. قم بإزالة أغطية أنابيب الشرائط وغطاء طبق الكاشف. بعد ذلك، أغلق باب محطة التحضير، وقم بتشغيل المقايسة المناسبة من لوحة التحكم.

لتصوير وعدّ الرموز الشريطية (barcodes) للمجمعات الثلاثية الموجهة والمثبتة، قم بإزالة الخرطوشة من محطة التحضير، واستخدم الغطاء المرفق لإغلاقها، ثم ضعها في أي فتحة متاحة في المحلل الرقمي. استخدم شاشة اللمس لإنشاء ملف تعريف الخرطوشة، أو ما يعرف بـ CDF. وتأكد من تعيين ملف مكتبة المراسل المناسب لكل عينة في ملف CDF.

بمجرد اكتمال عملية المسح، قم بتنزيل ملفات البيانات من المحلل الرقمي باستخدام محرك أقراص USB أو عبر البريد الإلكتروني، وذلك قبل معالجة البيانات وتحليلها وفقاً لبروتوكول مراقبة الجودة والتحليل المرتبط بها. يعمل نظام مقايسة منصة التعبير الجيني على تقليل الضوضاء التقنية من خلال طبيعته المؤتمتة للغاية، كما تنتج الكيمياء الفريدة التي يستخدمها بيانات عالية الدقة للتعبير الجيني. وتوضح المكررات التقنية الموضحة هنا مدى إمكانية تحقيق قابلية تكرار عالية في تقدير كمية التعبير عن microRNA الداخلي والفيروسي على حد سواء.

باستخدام هذه الطريقة، يمكن تحديد microRNAs البشرية الداخلية والمشفرة فيروسياً والتي تظهر انحرافاً عن التعبير المتوقع، كما هو محدد من قبل المشاركين الأصحاء في الدراسة، كأهداف ذات أهمية في متلازمة القولون المتهيج (IBS). وتسمح دقة وحساسية هذه الطريقة بالكشف عن الاضطرابات بين الأهداف ذات التعبير المنخفض، كما يمكن أيضاً ملاحظة الاضطرابات الطفيفة بشكل موثوق. توضح هذه الأشكال بعض الاضطرابات في microRNAs المتداولة في متلازمة القولون المتهيج، والأنماط الفرعية لمتلازمة القولون المتهيج، مقارنة بالمجموعات الضابطة السليمة.

يتم عرض أهم اثنين من جزيئات microRNAs التي ارتفعت مستوياتها بشكل تفاضلي لدى المشاركين المصابين بمتلازمة القولون العصبي (IBS) هنا. وتشير المنحنيات في مخطط الكمان (violin plot) هذا إلى تكرار عدد مرات ظهور miR-150. وتمثل الخطوط الرأسية الربيعين الأول والثالث، بينما يشير المربع الأحمر إلى العدد الوسيط.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء مقايسات مخصصة أكثر استهدافًا تعتمد على التقنية ذاتها من أجل التحقق من صحة بصمات المؤشرات الحيوية في مجموعات أكبر واستكشاف الارتباطات الأساسية بين البروتينات وRNA. وبعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الأبحاث الطبية الحيوية لتطوير لوحات مؤشرات حيوية تشخيصية للأمراض بسرعة ودقة وإتقان.