LED الحرارية تدفق - الجمع بين علم البصريات الوراثي مع التدفق الخلوي

الهدف العام من هذه الطريقة هو تحفيز المواد التي يتم التحكم فيها بصريا أثناء قياسات قياس التدفق الخلوي. يمكن أن يساعد هذا الجهاز الجديد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال إشارات الخلية من خلال الجمع بين قوة المواد التي يتم التحكم فيها بصريا وقياس التدفق الخلوي. لأول مرة ، يمكن توصيف الأدوات البصرية الوراثية وتحليلها باستخدام قياس التدفق الخلوي.

لم تكن هناك طريقة ثابتة مماثلة حتى اليوم. للبدء ، قم بتعليق الخلايا الليمفاوية راموس B المنقولة بتركيز مليون خلية لكل مليلتر ونقلها إلى أنبوب زجاجي FACS. بعد ذلك ، استبدل الحلقة O السوداء لمقياس التدفق الخلوي بحلقة مطاطية على شكل حرف O وقم بتطبيق شحم السيليكون لإنشاء ختم أفضل.

أدخل الأنبوب الزجاجي في مقياس التدفق الخلوي وضع النموذج الأولي لمؤشر LED حول الأنبوب مع إطفاء الأضواء. قم بقياس شدة مضان Dronpa في قناة GFP. الخطوة الأكثر أهمية في الإجراء هي التعامل مع الأنابيب الزجاجية.

أنابيب FACS الزجاجية هشة للغاية ، وبالتالي يوصى بممارسة إدخال الأنابيب الزجاجية في مقياس الخلوي قبل إجراء التجارب. بعد ذلك ، قم بتشغيل ضوء LED 500 نانومتر على السطح الخارجي للأنبوب ، واستمر في قياس شدة الفلور في Dronpa. قم بزيادة شدة مصابيح LED حتى تنخفض شدة مضان Dronpa ، من أجل تقدير الحد الأدنى من شدة الضوء المطلوبة ، من أجل قياس التبديل الضوئي لبروتين Dronpa-Linker-Dronpa.

بعد ذلك ، قم بتشغيل ضوء LED 400 نانومتر للنموذج الأولي في الجزء الخارجي من الأنبوب ، واستمر في قياس شدة مضان Dronpa. قم بزيادة شدة الضوء لأضواء LED 400 نانومتر حتى تزداد شدة مضان Dronpa. ابدأ باتباع تعليمات التصميم والتصنيع في بروتوكول النص المصاحب لتصنيع الطبقات الداخلية والخارجية لجهاز LED للتبديل الضوئي.

أدخل مصابيح LED ذات الطول الموجي 400 و 500 نانومتر في قنوات الجهاز. ألصقها في مكانها وقم بتوصيلها حسب التوجيهات. سيتم استخدام هذه الأطوال الموجية المحددة لتبديل بروتينات اندماج Dronpa-Linker-Dronpa بين حالاتها المظلمة والمشرقة.

بعد ذلك ، قم بتجميع الجهاز وتأكد من أنه محكم الغلق لمنع التسرب قبل تشغيل المحول. بعد تجميع الجهاز ، قم بحصاد الخلايا الليمفاوية راموس ب وتعليقها بكثافة تتراوح من ثلاثة إلى عشرة ملايين خلية لكل مليلتر. انقل 600 ميكرولتر من الخلايا إلى أنبوب زجاجي FACS.

ضعها على الجليد وقم بحماية الخلايا من الضوء حتى يتم قياسها. قم بتوصيل الجهاز المجمع بمضخة مياه ساخنة واضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، أدخل أنبوب FACS الزجاجي بعناية في الجهاز وقم بتوصيله بمقياس التدفق الخلوي.

سجل شدة فلورسنت Dronpa في قناة GFP. يشتمل تصميم هذه الأجهزة البصرية الوراثية على غرفة يمكن توصيلها بإمدادات مياه متداولة للحفاظ على درجة حرارة العينة عند قيمة ثابتة. بينما انبعث الجهاز من ثلاثة أطوال موجية مختلفة ، لم يلاحظ سوى زيادة هامشية في درجة الحرارة في عينة FACS ، عند تدفق 37 درجة مئوية من الماء عبر الجهاز.

تم استنساخ بنية اندماج Dronpa-Linker-Dronpa وتحويلها إلى خلايا Ramos B. عند توجيهه إلى حالة المونومر بواسطة مصدر ضوء 500 نانومتر ، تقل شدة الانبعاث. بعد ذلك ، بمجرد تحويل مصدر الضوء إلى ضوء 400 نانومتر ، يتم تغيير مونومر Dronpa بسرعة إلى حالة ثنائي ، وتزداد الشدة بسرعة.

باستخدام هذا الجهاز ، كان من الممكن تبديل بروتين اندماج Dronpa-Linker-Dronpa العصاري الخلوي عدة مرات. يحدث التحول إلى الحالة المظلمة ببطء ، بينما يحدث التحول إلى الحالة الساطعة على الفور تقريبا. يظهر التعافي الفلوري التلقائي ل Dronpa في الظلام أن التبديل الضوئي الفعال إلى الشكل الساطع يتطلب إضاءة محددة ويحدث ببطء فقط تلقائيا.

يظهر التحليل الحركي أن سرعة التبديل الضوئي قابلة للتكرار بشكل عام وأنه حتى بعد حضانة طويلة في الظلام ، يتم استرداد حوالي عشرة بالمائة فقط من التألق دون تبديل ضوئي. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء أي تحليل لقياس التدفق الخلوي ، بما في ذلك قياسات تدفق الكالسيوم ، من أجل استكشاف وظائف أداة البصريات الوراثية التي اخترتها. بعد تطويرها ، ستمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم البصريات الوراثي لاستكشاف أسلاك مسارات إشارات الخلية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء بروتوكول تبديل الصور لأداة البصريات الوراثية الخاصة بك. لا تنس أن الأشعة فوق البنفسجية يمكن أن تكون خطيرة للغاية ويجب دائما ارتداء الاحتياطات ، مثل النظارات الواقية ، أثناء تنفيذ هذا الإجراء.