التصور من الخلايا اللمفاوية معربا-22-IL عن طريق الفئران مراسل

الهدف العام من إجراء التعديل الجيني للفأر هو تحديد وتنقية وتوصيف الخلايا المناعية المنتجة ل IL-22. تطلق خلايا الجهاز المناعي وسطاء تسمى السيتوكينات وهي مسؤولة عن الدفاع عنا ضد العوامل الغريبة مثل البكتيريا واستعادة الأنسجة التالفة. IL-22 هو أحد هذه السيتوكين وقد نسب إليه العديد من الأنشطة التي تتراوح من إصلاح الأنسجة إلى علم الأمراض.

وقد تم الإبلاغ عن عدد من أنواع الخلايا المختلفة في الجهاز المناعي لتكون قادرة على إنتاجه. لذلك لتوضيح الخلايا التي تنتج بالفعل IL-22 ، قمنا بتطوير فأر مراسل جديد من طراز IL-22. مكننا ذلك من تحديد منتجي IL-22 المعنيين في الجسم الحي في الفئران في ظل الظروف العادية وفي نموذج مرض التهاب الأمعاء.

استخدمنا أيضا خلايا المراسل لتنقية مفسرات IL-22 لتحديد خصائصها الأخرى. تم تحديد طريقة توليد الفئران المراسلة بإيجاز ووصف طرق التحليل. يمكن تطبيق الطرق الموصوفة على الجينات الأخرى لأغراض تحديد المحربات وتنقية الخلايا التعبيرية القابلة للحياة لمزيد من التوصيف.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم المناعة حول الأنشطة البيولوجية ل IL-22 وخصائص الخلايا التي تنتجها. ستظهر الإجراء معي جولي هيكسون ، عالمة الأحياء ، وكارولين أندروز ، ما بعد الدكتوراه ، ووينتشينغ لي ، عالمة موظفة جميعها من مختبر الدكتور دورهام. بعد إدخال جين tdTomato reporter في ناقل مكوكي ، واستبدال جين GFP داخل نفس الموقع ، استخدم الكروموسوم الاصطناعي البكتيري المناسب ، أو قالب BAC لتضخيم مربعات التماثل A و B إلى أول exon مترجم ل IL-22 في نظام تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل سعة 50 ميكرولتر.

ثم قم بتحويل النواقل المنقاة إلى خلايا بكتيرية مختصة ب BAC على ألواح أجار لوريا بيرتاني أو LB تحتوي على الكلورامفينيكول والأمبيسلين عند 37 درجة مئوية. في نهاية الحضانة ، قم بتلقيح مستعمرتين إلى ثلاث مستعمرات في مليلتر واحد من مرق LB ، مع استكمال الكلورامفينيكول عند 37 درجة مئوية و 225 دورة في الدقيقة. بعد ساعة واحدة، وزعي 100 ميكرولتر من كل خليط على طبق أجار LB مكمل بالكلورامفينيكول والسكروز لزراعة ليلة واحدة عند 37 درجة مئوية.

في صباح اليوم التالي ، أعد وضع المستعمرات الكبيرة على صفيحة أجار LB جديدة مع الكلورامفينيكول والمستعمرات الصغيرة على صفيحة أجار LB أخرى وعرض الألواح للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 ثانية. ثم حدد مستعمرة حساسة للأشعة فوق البنفسجية واستخدم برايمر متغاير الزيجوت tdTomato IL-22 لتأكيد وجود الحمض النووي BAC المعدل بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). بعد إزالة الطحال والغدة الصعترية ، استخدم ملقط تشريح مسنن دقيق لحصاد الغدد الليمفاوية المساريقية البيضاء اللؤلؤية بالقرب من جدار الأمعاء الدقيقة.

بعد ذلك ، قم بإزالة الأمعاء الدقيقة والقولون بالكامل واستخدم المقص لاستخراج بقع باير البيضاوية الممتدة على طول الأمعاء. عندما يتم جمع جميع الأنسجة الليمفاوية ، قم بطحن الغدد الليمفاوية المساريقية وبقع باير معا بين شريحتين بلوريتين في PBS مكملة ب FBS على الجليد. بعد توليد معلقات فردية من الطحال والغدة الصعترية أحادية الخلية بنفس الطريقة ، اتبعت أجهزة الطرد المركزي خلايا الطحال تحلل خلايا الدم الحمراء الطحالية مع مليلتر واحد من طحال ACK Lysing Buffers.

بعد دقيقة واحدة ، استرجع متساوي التوتر بتسعة ملليلتر من PBS وقم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى. أعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من PBS وقم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة خلية 100 ميكرون. ثم اجمع الخلايا عن طريق طرد مركزي آخر ، وأعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من وسط RPI للتعداد عن طريق استبعاد التريبان الأزرق.

بعد حصاد الأمعاء الدقيقة من الاثني عشر إلى الدقاق جنبا إلى جنب مع القولون بأكمله ، استخدم الملقط لإزالة الأنسجة الدهنية والمساريقية الزائدة من الأمعاء ووضع أنسجة الأمعاء على الفور في PBS البارد المثلج. استخدم الملقط لحصاد بقع باير على طول المنطقة البعيدة من الأمعاء الدقيقة. ثم استخدم المقص لفتح الأمعاء بالطول وغسل الأنسجة جيدا ب 10 مل من PBS المثلج.

انقل العينة إلى 20 مل من المخزن المؤقت لما قبل الهضم لمدة حضانة مدة كل منهما 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 50 دورة في الدقيقة في شاكر ، وقم بتدوير الأنسجة لمدة 30 ثانية عند 12،000 دورة في الدقيقة والضغط على جميع الأجزاء من خلال مصفاة خلية 100 ميكرون في نهاية كل حضانة لجمع طبقة الخلية الظهارية. بعد ذلك ، أضف 20 مل من محلول EDTA الطازج إلى ملاط الخلية لمدة 30 دقيقة أخرى مع الرج عند 37 درجة مئوية ، وتصفية وتبريد الخلايا الظهارية المعوية في نهاية الحضانة كما هو موضح للتو. ضع شظايا الأمعاء المتبقية على الجليد واجمع الخلايا الظهارية المعوية المجمعة عن طريق الطرد المركزي ، متبوعا بغسل 10 مل من HBSS مكمل ب FBS.

أعد تعليق الحبيبات المغسولة في ثمانية ملليلتر من وسط السيليكا الغروية 44٪ وتراكب تعليق الخلية بخمسة ملليلتر من وسط السيليكا الغروية 67٪. افصل الخلايا عن طريق الطرد المركزي واستخدم ماصة سعة مليلتر واحد لإزالة أعلى خمسة ملليلتر من وسط فصل الخلايا. ثم اجمع الخلايا في الواجهة واغسل الخلايا الظهارية المعوية في 10 ملليلتر من وسط RPMI ، مع تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من RPMI الطازج.

بعد تحضير معلقات خلية طحال واحدة من فئران IL-22 td-Tomato كما هو موضح للتو. أعد تعليق الخلايا عند تركيز واحد في 10 إلى الخلايا السابعة لكل مليلتر في PBS المعقم واستخدم طريقة العزل السلبي لخلايا CD4 للفأر لتنقية الخلايا التائية الإيجابية CD4. بعد ذلك ، قم بتسمية الخلايا التائية بالأجسام المضادة ل CD4 ومضادة ل CD45RB لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

في نهاية الحضانة ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي متبوعا بغسل في ملليلترين من PBS المكمل ب FBS. أعد تعليق الحبيبات المغسولة في مليلتر واحد من PBS و FBS الطازجة وفرز الخلايا التائية المسماة عن طريق قياس التدفق الخلوي بواسطة التعبير المشترك CD4 و CD45RB. عندما يتم فرز جميع الخلايا ، قم بجمعها عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات عند 1 في 10 إلى ست خلايا لكل تركيز مليلتر في PBS المعقم لحقن الخلايا في متلقي الفأر بالضربة القاضية RAG1.

لإنشاء مراسل الفئران IL-22 ، تم استخدام إعادة تركيب الجينات المعدلة وراثيا لتعديل كروموسوم اصطناعي بكتيري يحمل جراد IL-22 والذي يحتوي أيضا على علامة اختيار إيجابية وجين مقاومة للمضادات الحيوية كلورامفينيكول. بعد إدخال tdTomato في exon1 ، تم تعطيل تسلسل ببتيد الإشارة ، مما أدى إلى محاصرة مراسل tdTomato داخل الخلايا التي تعبر عن IL-22 وتمكين اكتشافها وعزلها عن طريق قياس التدفق الخلوي. لاختبار دقة مراسلي IL-22 ، يمكن استزراع خلايا الطحال المتولدة في المختبر تحت Th22 أو ظروف محايدة مع تعبير IL-22 tdTomato الواضح عن طريق كل من قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري الفلوري.

في الجسم الحي ، اكتشف مراسلو IL-22 في أنسجة الفئران المختلفة في ظل ظروف التماثل مع ملاحظة معظم الإشارة في خلايا الصفيحة المخصوصة من الأمعاء ، ولكن ليس في العقدة الليمفاوية الإبطية أو الطحال أو الغدة الصعترية. في نموذج التهاب القولون في الفأر الناجم عن نقل خلايا التائية المرتفعة CD4 الإيجابية CD4 إلى الفئران بالضربة القاضية RAG1 ، يتم تصور مراسلي tdTomato لأول مرة في الغدد الليمفاوية المساريقية ، ولكن تراكمها في نهاية المطاف مع الصفيحة الخاصة بالأمعاء الدقيقة البعيدة وأنسجة القولون. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر اختيار استنساخ BAC المناسب.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل إنشاء نماذج عدوى الرئة أو الجلد باستخدام هذا الفأر المراسل للإجابة على أسئلة إضافية حول دور IL-22 في الدفاع عن المضيف وإصلاح الأنسجة. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم المناعة لاستكشاف وظيفة البروتينات المفرزة التي تظهر تعبيرا منخفضا باستخدام نموذج فأر مثل هذا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء فأر مراسل معدل وراثيا وتحديد جينات مراسل IL-22 في المختبر وفي الجسم الحي.