Name: طريقة بديلة لإعداد نموذج مع انخفاض عدد الخلايا لتحليل تيم (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: تعلم طريقة إعداد عينات ذات عدد خلايا منخفض لتحليل المجهر الإلكتروني النافذ، باستخدام 10,000 خلية جذعية نقوية. هذه التقنية توفر نتائج نوعية وكمية موثوقة في سياق فسيولوجي حقيقي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر مركز أبحاث علم الأمراض للمساعدة في دراسات تحليل المجهر الإلكتروني في المركز الطبي لمستشفى سينسيناتي للأطفال. تم دعم العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (جائزة جسر الجمعية الأمريكية لأمراض الدم إلى MDF. R01 DK102890 إلى MDF).

وقد وافق جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنة الحيوان المؤسسية في مؤسسة أبحاث سينسيناتي للأطفال. لهذه الدراسة، تم عزل الخلايا الجذعية المكونة للدم من نخاع العظام من C57BL / 6 الفئران الفطرية الذين تتراوح أعمارهم بين 2-4 أشهر. الفرز الخلية باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية بعد تلطيخ BM مع صناع سطح مختلفة بما في ذلك النسب، ج كيت، هيئة السلع التموينية-1، واستخدمت Flt3 وCD34 لتنقية شهادة الثانوية العامة على أساس Lin- هيئة السلع التموينية-1 + ج + كيت Flt3 - CD34 - النابضة استراتيجية كما وصف بروتوكول قياسي قبل 8. تنبيه: وتستخدم عدة مواد كيميائية شديدة السمية أثناء هذا الإجراء. هذه هي سامة عن طريق الإستنشاق وملامسة الجلد. يرجى ارتداء القفازات والملابس الواقية. العمل في غطاء الدخان بينما كان يعمل مع هذه المواد الكيميائية. 1. الخلايا، التثبيت، تلطيخ وقبل التضمين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نوع 10000 الخلايا الجذعية المكونة للدم (باستخدام لين - هيئة السلع التموينية-1 <suص&gt; + ج + كيت Flt3 - CD34 - النابضة الاستراتيجية؛ السكان LT-شهادة الثانوية العامة) في أنبوب 1.5 مل microcentrifuge تحتوي 600 ميكرولتر التعديل Dulbecco Iscove لوالمتوسطة (IMDM) مع 10٪ مصل بقري جنيني باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور باستمرار HSCs فرزها في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل باستخدام جهاز للطرد المركزي مع دلاء أرجوحة بها. إزالة المتوسطة من قبل التطلع لطيف وترك 200 ميكرولتر المتوسطة في أنابيب في كل خطوة. في هذه المرحلة، لا يزال بيليه خلية غير مرئية في الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 0.2 مل من محلول تثبيتي 2X في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 ساعة 1،9. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل الحل تثبيتي الطازجة قبل استخدامها. في 1X، ويتألف الحل من 3٪ امتصاص العرق و 2.5٪ غلوتارالدهيد في 0.1 م العازلة كاكوديلات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الخلايا في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة عند 30 درجة مئوية باستخدام أجهزة الطرد المركزي مع دلاء البديل التدريجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع 600 ميكرولتر من العازلة 0.1 M كاكوديلاتباستخدام الطرد المركزي وترك العازلة 200 ميكرولتر في الأنبوب بعد الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار على الخلايا الثابتة بإضافة 200 ميكرولتر من 2 ملغ حل / مل من إيفانس الأزرق في المخزن كاكوديلات واحتضان لمدة 20 دقيقة في RT. سوف تكون ملونة الخلايا الأزرق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا 3 مرات مع 600 ميكرولتر من 0.1 M عازلة كاكوديلات باستخدام الطرد المركزي وترك العازلة 200 ميكرولتر في الأنبوب في كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق الخلايا في 200 العازلة ميكرولتر ونقل تعليق خلية إلى أنبوب 0.5 مل. أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة باستخدام جهاز للطرد المركزي أعلى الجدول. إزالة العازلة بلطف من دون إزعاج الآن مرئية بيليه خلية صغيرة، وترك عازلة 50 ميكرولتر في الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ملغ انصهار منخفضة الاغاروز إلى 5 مل من 0.1 M عازلة كاكوديلات في أنبوب 15 مل عن حل الاغاروز 4٪. إذابة الاغاروز عن طريق نقل أنبوب إلى الماء المغلي في زجاجة 100 مل والحفاظ فاتر حتى استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من 4٪ انصهار منخفضة حل الاغاروز في 0.1 M cacodylaالشركة المصرية للاتصالات عازلة لتعليق الخلية في أنبوب 0.5 مل وعلى الفور أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة عند 30 درجة مئوية باستخدام أعلى الجدول الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التأكد من أن الخلايا مكعبات في الجزء السفلي من أنبوب 0.5 مل في الاغاروز شبه صلبة بعد الطرد المركزي، ونقل على الفور الأنبوب إلى 4 درجات مئوية أو الثلج لمدة 20 دقيقة لترسيخ الاغاروز. هذه الخطوة هي حرجة للغاية، وبيليه خلية مرئية صغير في هذه النتائج خطوة في كتلة جيدة من الخلايا تحت المجهر الالكتروني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بعناية الاغاروز طدت تحتوي على بيليه خلية من الأنبوب إلى 35 مم البلاستيك طبق بتري تحتوي العازلة باستخدام 27 إبرة G 3،10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم الاغاروز المتصلبة التي تحتوي على بيليه خلية في قطعة واحدة من حوالي 1-2 ملم مع مشرط. نقل قطعة الاغاروز التي تحتوي على بيليه الخلية إلى أنبوب 1.5 مل جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل 2-3 مرات باستخدام 600 ميكرولتر من العازلة 0.1 M كاكوديلات عن طريق إضافة وإزالة العازلة باستخدام ماصة دون الطرد المركزي. استخدام هذه القطعة الاغاروز التي تحتوي على بيليه خلية للخطوة التالية. في هذه الخطوة، يمكن تخزين العينة عند 4 درجات مئوية خلال الليل قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. </li></ol> 2. المعاملة بالأوزميك، الجفاف، تضمين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المنطقة العازلة كاكوديلات من أنبوب 1.5 مل مع بيليه الخلية التي تحتوي على الاغاروز باستخدام ماصة. إضافة 1.0 مل من 1٪ أكسيد الأوزميوم الثماني (أوسو 4) حل في غطاء الدخان، واحتضان لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل ثلاث مرات مع 600 ميكرولتر من 0.1 M عازلة كاكوديلات ونقل العينة إلى 20 مل الزجاج التلألؤ قنينة مع غطاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معالجة عينة من الجفاف، تسلل وتضمينها في الراتنج (على سبيل المثال، LX-112) مع تغييرات المسلسل من الحلول التالية في لوحة 6 جيدا. نقل الاغاروز قطعة خلية بيليه باستخدام ملقط. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج العينة في 25٪ من الإيثانول في RT لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج العينة في 50٪ من الإيثانول في RT لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج العينة في 75٪<html> الإيثانول في RT لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج العينة في 95٪ من الإيثانول في RT لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج العينة في الإيثانول بنسبة 100٪ في RT لمدة 15 دقيقة، مرتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج العينة في الإيثانول: الراتنج (3: 1) في RT لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج العينة في الإيثانول: الراتنج (1: 1) في RT لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج العينة في الإيثانول: الراتنج (1: 3) في RT لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج العينة في الراتنج النقي في RT لمدة 60 دقيقة، مرتين. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العينة إلى الجزء السفلي من الهرم طرف العفن على شكل المطاط باستخدام ملقط بعناية وإضافة الراتنج أكثر نقاء على رأس عينة لملء القالب. احتضان العينة على 60 درجة مئوية لمدة 72 ساعة للبلمرة الراتنج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة هرم راتنج بلمرة من القوالب قبل التواء في قالب من المطاط. وينبغي أن تكون كتلة سوداء صغيرة من الخلايا مرئية في هرم راتنج بلمرة، كما هو موضح سابقا 7. إرفاق هرم راتنج بلمرة على اسطوانة تصاعد استخدام cyanoacrylate. </li></ol>معشوقة = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. باجتزاء ونقل المجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقليم كتلة الهرم بشفرة حلاقة وسكين الماس بعد تصاعد كتلة على مشراح-فائقة. جعل قصيرة شكل شبه منحرف واسعة مع الجزء العلوي والجزء السفلي من كتلة موازية لبعضها البعض، ومع الجانبين الزاوية بالتساوي. هذا الشكل من الهرم يساعد لباجتزاء المسلسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وعلاوة على ذلك، وتقليم كتلة حول الخلية بيليه مع سكين الماس وإزالة الأجزاء البلاستيكية حول الخلية بيليه الاغاروز قطعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع 1 ميكرون المقاطع باستخدام وسيلة مشراح جدا. نقل 1 ميكرون المقاطع من قارب الماء لشريحة زجاجية باستخدام أداة رمش وأداة حلقة معدنية كما ذكرت سابقا 7. نقل المقاطع على الشرائح والشرائح نقل إلى صفيحة ساخنة (37 درجة مئوية) لمدة التجفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قطرة من طولويدين حل الأزرق إلى أقسام باستخدام حقنة مجهزة 0.22 ميكرون تصفية واحتضان لمدة 3 دقائق. شطف الشرائح مع الماء المقطر ولوآخرون الأقسام تجف. تحقق مع المجهر الضوئي لتحديد موقف من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع المقاطع رقيقة جدا (70-100 نانومتر) باستخدام سكين الماس. نقل 2-3 أقسام على شبكات 200 شبكة من القارب المياه إلى طبق بيتري الزجاج باستخدام أداة رمش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الزجاج طبق بتري تحتوي على شبكات مع أقسام لوحة الساخنة عند 30 درجة مئوية لتجف أقسام لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار على شبكات مع قطرات من 1٪ خلات اليورانيل في RT لمدة 10 دقيقة ثم يشطف في الماء المقطر 6-8 مرات. وصمة عار مع رينولدز يؤدي سيترات، في RT لمدة 5 دقائق ويشطف في الماء المقطر 6-8 مرات. نقل الزجاج طبق بتري تحتوي على شبكات لوحة الساخنة عند 37 درجة مئوية لتجف أقسام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل المقاطع باستخدام المجهر الإلكتروني، في 80 كيلو فولت 7. </li></ol>

<ol><li>Bozzola, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+specimen+preparation+techniques+for+transmission+electron+microscopy+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).</li>
<li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+techniques+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr Opin Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li>
<li>Anderson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+preparing+peripheral+leucocytes+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ulstract+Res%22%5BJournal%5D)">A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy.</a> J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).</li>
<li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+scarce+biological+samples+for+light+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Histochem%22%5BJournal%5D)">Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy.</a> Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).</li>
<li>Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+removal+of+selected+cells+from+cytological+smear+preparations+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy.</a> J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).</li>
<li>Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+flat-embedding+method+to+prepare+ultrathin+cryosections+from+cultured+cells+in+their+in+situ+orientation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation.</a> J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).</li>
<li>Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+reproducible+process+for+transmission+electron+microscopy+%28TEM%29+of+rare+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations.</a> J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).</li>
<li>Hopwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reactions+between+formaldehyde%2C+glutaraldehyde+and+osmium+tetroxide%2C+and+their+fixation+effects+o+bovine+serum+albumin+and+on+tissue+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks.</a> Histochemistry. 24, 50-64 (1970).</li>
<li>Saini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+synthase+localization+in+the+rat+neutrophils%3A+immunocytochemical%2C+molecular%2C+and+biochemical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies.</a> J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+small+GTPase+Rap1b+negatively+regulates+neutrophil+chemotaxis+and+transcellular+diapedesis+by+inhibiting+Akt+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation.</a> J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).</li>
</ol>

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

تمكن هذه الطريقة تحليل تيم على أرقام الهواتف المحمولة المنخفضة، باستخدام ايفانز تلطيخ الأزرق والاغاروز التضمين في توطين بيليه خلية صغيرة خلال الجفاف، التضمين الراتنج والعمليات باجتزاء. الأهم من ذلك أنها تحتفظ مجموعات الخلايا معا، ويحافظ على الخلية فائقة هيكل، الذي أمر مرغوب فيه لفحص خلايا متعددة لتقدير حجم البيانات. في دراسات تيم، بيليه الخلية التي تحتوي ملايين الخلايا في كثير من الأحيان اللازمة لالغرز كفاءة إلى ...

وقد تم كشف النقاب عن تفاصيل فائقة الهيكلية وشبه العضيم بصفة أساسية من الخلايا بواسطة المجهر الإلكتروني انتقال (تيم) دراسات من الأنسجة أو الكريات خلية 1،2. القطع الصلبة من أنسجة يمكن استخدامها بسهولة للدراسات المجهر الإلكتروني. ومع ذلك، تيم يحلل 1،3 على الخلايا في تعليق تظل صعبة وتتطلب أعداد الخلايا عالية، أي الملايين من الخلايا. وبسبب هذا، تحليلات فائقة الهيكلية للسكان الخلية نادر في التعليق، وعلى سبيل المثال، الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs)، لا يتم تقييمها بسهولة. فشلت محاولات متعددة لتحليل تيم من العينات النادرة باستخدام cytospin أو أحادي الطبقة النهج للحصول على بيانات كمية كبير من عدد محدود من الخلايا. وهكذا، فإن اشتراط وجود عدد الخلايا عالية يحد من استخدام هذه الأداة القوية لفهم تفاصيل التركيبية التحت خلوية من السكان الخلية نادرة. والقيد الرئيسي للدراسات تيم مع عدد محدود من الخلاياالصورة في تعليق هو توطين الخلايا للمعالجة، وبالتالي، لا تزال الدراسات تيم من خلايا محدودة مع بخاصة الأحجام الصغيرة الصعبة. وقد تم اعتماد عدة أساليب بديلة لمواجهة هذا القيد: جيش صرب البوسنة / bisacrylamide (BSA-BA) البلمرة بوساطة من تعليق خلية، وتلطيخ الخلايا مع صبغة لجعلها مرئية على دعم رقيقة بما coverslips، وتيم يحلل من الاستعدادات cytospin 4-6. ومع ذلك، تم تحقيق نجاح محدود جدا، كما تم العثور على عدد قليل جدا من الخلايا في الفروع بعد فائقة باجتزاء. التحدي الرئيسي المتمثل في تحديد الخلايا المتفرقة استمرت لأحادي الطبقة الخلية لا تزال في معظمها غير مرئية في هلام طدت لباجتزاء. وعلاوة على ذلك، وإعداد cytospin من الخلايا قد يغير منظمتهم الخلوية بسبب انتشار الخلايا وهشاشة بنية الخلية. وبالتالي، هذه العيوب المتأصلة تستدعي نهجا جديدا لإجراء دراسات تيم من السكان الخلية نادرة مع أكثرالتناسق. للتغلب على هذه المشكلة، التي وصفناها رواية وعينة بديلة طريقة التحضير للدراسات تيم من السكان الخلية نادرة 7. هنا، نحن الإبلاغ عن كفاءة بروتوكول إعداد نموذج لأداء تيم من العينات البيولوجية النادرة مع النتائج النوعية والكمية متسقة. تم إجراء ايفانز تلطيخ الأزرق بعد تثبيت لتوطين بيليه خلية صغيرة من الخلايا انخفاض عدد، أي 10000 نخاع العظم الجذعية المكونة للدم والخلايا الاولية التي لولاها بقيت غير مرئية، وكان جزءا لا يتجزأ من بيليه إلى الاغاروز قبل عمليات الجفاف والراتنج التضمين. هذه الطريقة مجموعات الخلايا معا، ويمكن تحليل كفاءة التركيب الدقيق وتنظيم التحت خلوية من الخلايا الجذعية المكونة للدم (يدعى لين - هيئة السلع التموينية-1 + ج كيت + Flt3 - CD34 -، شهادة الثانوية العامة)، نادر 0.2 - السكان الخلية 0.5٪ في نخاع العظام. هذا الموالية التجريبيtocol يمكن أن تكون مفيدة لإجراء دراسات فائقة الهيكلية والحصول على النتائج الكمية على العديد من السكان نادر لكنه مهم للغاية.

<table><tbody><tr><td>بارافورمالدهيد 20٪</td> علوم <td>المجهر الإلكتروني</td> المائي <td>15713</td><td><قوي > < / قوي> سام عن طريق الاستنشاق ، ملامسة الجلد. ارتداء القفازات ، واستخدام غطاء الدخان.</td></tr><tr><td>الجلوتريraldehyde 70٪</td> علوم <td>المجهر الإلكتروني</td> المائي <td>Soln 16350</td><td><قوي > الحذر < / قوي> سام عن طريق الاستنشاق ، ملامسة الجلد. ارتداء القفازات ، واستخدام غطاء الدخان.</td></tr><tr><td>كاكوديلادات عازلة&nbsp;</td><td>علوم المجهر الإلكتروني</td><td>12300</td><td>اصنع 0.1 M Cacodylaate Buffer (درجة الحموضة 7.4) في الماء المقطر ، وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية. <قوي > الحذر < / قوي> مهيج عن طريق الاستنشاق أو ملامسة الجلد ، وارتداء القفازات والعمل في غطاء الدخان.</td></tr><tr><td>إيفانز بلو&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E-2129</td><td></td></tr><tr><td>منخفض الذوبان agarose&nbsp;</td><td>علوم مجهر رابع أكسيد الأوزميوم Sigma Aldrich</td><td>A-5030</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>1</td><td>جم في 50 مل من 0.1 M cacodyladate buffer لصنع 2٪ OsO 4 ، <قوي > حذر < / قوي> شديد السمية عن طريق الاستنشاق أو ملامسة الجلد ، مؤكسد قوي ، ارتداء ملابس واقية ، حماية العين ، استخدم غطاء الدخان.</td></tr><tr><td>LX-112 مجموعات التضمين (LADD&reg;)< / قوي ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>DDSA (أنهيدريد Dodecenylsuccinic) LADD</td><td></td> <td>21340</td><td>امزج 16٪ DDSA ؛ 30٪ NMA ؛ 54٪ LX-112 معا ثم أضف 1.4٪ DMP-30</td></tr><tr><td>NMA (Nadic ميثيل أنهيدريد) LADD</td><td></td> <td>21350</td><td></td></tr><tr><td>راتنجات الايبوكسي Epon 812 (LX-112) LADD</td><td></td> <td>21310</td><td><قوي > الحذر < قوي> سام عن طريق الاستنشاق ، ملامسة الجلد. ارتداء القفازات والملابس الواقية واستخدام غطاء الدخان.</td></tr><tr><td>DMP-30 (2،4،6-Tri (ثنائي ميثيل أمينوميثيل) الفينول) LADD</td><td></td> <td>21370</td><td></td></tr><tr><td>سترات الرصاص رينولدز (EM Stain II) Leica</td><td></td><td></td><td>CAUTION< / قوي> سام عن طريق الاستنشاق ، تجنب ملامسة الجلد أو العينين.</td></tr><tr><td>أسيتات اليورانيل (EM Stain I)</td><td>Leica</td><td>8072820</td><td>CAUTION< / قوي> سام عن طريق الاستنشاق ، تجنب ملامسة الجلد أو العينين.</td></tr>تكوين <tr><td>Dulbecco المعدل من Iscove (IMDM)</td> <td>ATCC</td><td>30-2005</td><td>: كلوريد الصوديوم ، NaHCO 3 ، HEPES ، الجلوكوز ، الكالسيوم ، المغنيسيوم ، البيروفات الحمضية etc. للحصول على تفاصيل https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx</td></tr><tr><td>قالب طرف هرمي &nbsp ؛</td><td>تيد بيلا</td><td>10585</td><td></td></tr><tr><td>تصاعد اسطوانات</td><td>تيد بيلا</td><td>10580</td><td></td></tr><tr><td>الترا ميكروتوم&nbsp;</td><td>(Leica EM UC7)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>200 شبكة شبكية (نيكيل) علوم</td> <td>المجهر الإلكتروني</td><td>G-200 مجهر إلكترون نيكل</td><td></td></tr><tr><td></td><td>هيتاشي موديل H-7650 &nbsp ؛</td><td></td><td></td></tr><tr><td>برنامج محرك التقاط الصور</td><td>AMT-600 &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 مم أطباق بتري بلاستيكية</td><td>فيشر العلمية</td><td></td><td></td></tr><tr><td>سريعة بوند سوبر الغراء Cyanoacrylate&nbsp;</td><td>علوم المجهر الإلكتروني</td><td>72588</td><td></td></tr><tr><td>شفرات</td><td></td><td></td><td></td>الحلاقة</tr><tr><td>قوارير زجاجية تلألؤ&nbsp;</td><td>فيشر العلمي&nbsp;</td><td>03-337-14</td><td></td></tr><tr><td>شرائح زجاجية&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>أداة</td><td></td><td></td><td></td>رمش</tr> أداة <tr><td>حلقة معدنية&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

طريقة بديلة لإعداد نموذج مع انخفاض عدد الخلايا لتحليل تيم

An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

انتقال المجهر الإلكتروني (تيم) على تفاصيل تنظيم الخلوية والتركيب الدقيق. ومع ذلك، وتحليل تيم من السكان الخلية نادرة، وخاصة الخلايا في تعليق مثل الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs)، لا يزال محدودا نظرا لاشتراط وجود عدد الخلايا عالية أثناء إعداد العينات. هناك عدد قليل من cytospin أو أحادي الطبقة نهج لتحليل تيم من عينات نادرة، ولكن هذه الأساليب تفشل في الحصول على بيانات كمية كبيرة من عدد محدود من الخلايا. هنا، يتم وصف نهج بديل ورواية لإعداد العينات في الدراسات تيم لسكان الخلية النادرة التي تمكن من تحليل الكمي. عدد الخلايا منخفضة نسبيا، أي 10000 HSCs، وقد استخدمت بنجاح لتحليل تيم مقارنة ملايين الخلايا التي تستخدم عادة لدراسات تيم. على وجه الخصوص، تم تنفيذ ايفانز تلطيخ الأزرق بعد امتصاص العرق، غلوتارالدهيد (PFA-GA) تثبيت لتصور ااا خلية صغيرةالسماح، الأمر الذي سهل مبنية الاغاروز. وقد لوحظت مجموعات من الخلايا عديدة في قطاعات رقيقة جدا. كانت الخلايا التشكل الحفاظ عليها بشكل جيد، وكانت التفاصيل فائقة الهيكلية للالميتوكوندريا جولجي المعقدة وعدة مرئية. يسمح هذا البروتوكول كفاءة، وسهلة وقابلة للتكرار تحضير عينات من عدد الخلايا منخفضة، ويمكن استخدامها لتحليل تيم النوعي والكمي على السكان الخلية نادرة من العينات البيولوجية محدودة.

بروتوكول فعال وثابت لإعداد نموذج لأداء تحليل تيم من يوصف انخفاض عدد الخلايا. ساعد بعد تثبيت تلطيخ مع ايفانز الأزرق ونقل الخلايا إلى أنبوب 0.5 مل microcentrifuge لتصور بيليه خلية صغيرة 7. المعاملة بالأوزميك مع tetraoxide الأوسيميوم في الاغاروز أدى إلى سهولة اكتشاف من بيليه الخلية الظلام خلال الجفاف والتضمين. وأكدت أقسام شبه رقيقة من الكتل...

هنا ، نقدم بروتوكولا لإعداد عينات ذات أعداد خلايا منخفضة لتحليل المجهر الإلكتروني (TEM).

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير عينات ذات أعداد خلايا منخفضة لإجراء تحليل TEM بطريقة فعالة وقابلة للتكرار. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الكشف عن جميع تراكيب الخلايا الحقيقية وتوفير إعدادات فسيولوجية أفضل في المجال الطبي الحيوي. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية الحصول على نتائج نوعية وكمية من أعداد خلايا منخفضة وبطريقة قابلة للتكرار.للبدء، استخدم تقنية FACS لفرز 10,000 من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL، يحتوي على 600 µL من وسط Dulbecco المعدل (Isocoves) مع 10% FBS. وباستخدام جهاز طرد مركزي ذي دلاء متأرجحة، قم بترسيب الخلايا الجذعية المفرزة عند 1,000 ×g لمدة 10 دقائق.استخدم الشفط اللطيف لإزالة الوسط باستثناء 200 µL منه. ولتثبيت الخلايا، أضف 0.2 mL من محلول التثبيت بتركيز 2X المُحضّر حديثاً، واتركها لتحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، أضف 600 µL من محلول كاكوديلات المنظم بتركيز 0.1 molar لغسل الخلايا.قم بطرد الخلايا مركزياً مرة أخرى، هذه المرة عند 30 °C. بعد الطرد المركزي، قم بإزالة جميع السوائل باستثناء 200 µL من المنظم، ثم أضف 200 µL من evans blue بتركيز 2 mg/mL في منظم cacodylate، واحضن الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لصبغها. استخدم 600 µL من منظم cacodylate بتركيز 0.1 M لغسل الخلايا ثلاث مرات.ثم أعد تعليق الخلايا في الـ 200 µL المتبقية من المنظم قبل نقل معلق الخلايا إلى أنبوب سعة 0.5 mL. في هذه الخطوة، يجب أن تكون الكتلة المترسبة مرئية في الأنبوب. وباستخدام جهاز طرد مركزي مكتبي، قم بتدوير الخلايا عند 1,000 ×g لمدة 10 دقائق.ثم قم بإزالة المحلول المنظم بلطف دون تحريك كتلة الخلايا الصغيرة التي أصبحت مرئية الآن، مع ترك 50 µL من المحلول المنظم في الأنبوب. قم بتحضير محلول أغاروز بتركيز 4%، عن طريق إضافة 200 mg من الأغاروز منخفض الانصهار إلى 5 mL من محلول كاكوديلات المنظم بتركيز 0.1 molar في أنبوب سعة 15 mL. قم بصهر الأغاروز عن طريق نقل الأنبوب إلى ماء مغلي في زجاجة مائية سعة 100 mL.أضف 200 µL من محلول الأغاروز إلى أنبوب معلق الخلايا. قم بالطرد المركزي فوراً عند 1,000 ×g، وبدرجة حرارة 30 °C لمدة 10 دقائق. بعد التأكد من تكتل الخلايا في الأغاروز شبه الصلب في قاع الأنبوب، انقل الأنبوب فوراً إلى درجة حرارة 4 °C، أو إلى الثلج، لمدة 20 دقيقة لتجميد الأغاروز.باستخدام إبرة قياس 27، انقل بعناية أغاروز المتصلب الذي يحتوي على كتلة الخلايا إلى طبق بتري بلاستيكي سعة 35 mL يحتوي على محلول cacodylate المنظم بتركيز 0.1 molar. وباستخدام المشرط، قم بقص الأغاروز المتصلب الذي يحتوي على كتلة الخلايا إلى قطعة واحدة يتراوح حجمها بين واحد إلى اثنين مليمتر. ثم انقلها إلى أنبوب جديد سعة 1.5 mL.أضف 600 µL من محلول كاكوديلات المنظم بتركيز 0.1 M، واغسل كتلة الخلايا في الأجاروز باستخدام الماصة لإضافة المحلول المنظم وإزالته. تخلص من المحلول المنظم من كتلة الخلايا، ثم أضف 1 mL من محلول رابع أكسيد الأوزميوم بتركيز 1% داخل خزانة استرداد الأدخنة، مع ضرورة ارتداء الملابس الواقية والقفازات. حضّن كتلة الخلايا عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعة واحدة.بعد انتهاء فترة الحضن، اغسل العينة ثلاث مرات. انقلها إلى قارورة وميض زجاجية سعة 20 mL ذات غطاء. بعد ذلك، قم بتجفيف العينة باستخدام سلسلة من الإيثانول.ثم قم بتغلغل العينة في تركيزات متزايدة من راتنج LX 112 في الإيثانول قبل التحضين في راتنج بتركيز 100% مرتين لمدة 60 دقيقة في كل مرة. وباستخدام الملاقط، انقل العينة بعناية إلى قاع قالب مطاطي على شكل رأس هرمي، وأضف الراتنج النقي فوق العينة لملء القالب. حضن العينة عند 60 °C لمدة 72 ساعة لبلمرة الراتنج.عندما يتلمر الراتنج، قم بإزالته من القوالب عن طريق تدوير القالب المطاطي. يجب أن تظهر مجموعة صغيرة سوداء من الخلايا داخل هرم الراتنج المتلمر. استخدم السيانوأكريليت لتثبيت هرم الراتنج المتلمر على أسطوانة تثبيت لغرض التقطيع.بعد تثبيت القالب على جهاز القطع الدقيق جداً (ultramicrotome)، استخدم شفرة حلاقة وسكيناً ماسياً لتقليم القالب الهرمي، بحيث يتشكل شكل شبه منحرف قصير وعريض، مع جعل أعلى القالب وأسفله متوازيين، وبجوانب ذات زوايا متساوية. ثم استخدم السكين الماسي لتقليم القالب حول كتلة الخلايا وإزالة المقاطع البلاستيكية المحيطة بقطعة الأجاروز التي تحتوي على كتلة الخلايا. وباستخدام جهاز القطع الدقيق جداً، قم بقص مقاطع بسمك 1 µm، واستخدم أداة الرموش وحلقة معدنية لنقل المقاطع من حمام الماء إلى شريحة زجاجية.بعد ذلك، ضع الشرائح على لوح تسخين عند 37 درجة Celsius للتجفيف. وباستخدام سرنجة مزودة بمرشح 0.22 micrometer، أضف قطرة من محلول teluatine blue إلى المقاطع واتركها تحضن لمدة ثلاث دقائق. ثم اشطف الشرائح بالماء المقطر واترك المقاطع لتجف.بعد التجفيف، افحص المقاطع باستخدام مجهر ضوئي لتحديد موقع الخلايا. بعد ذلك، استخدم سكيناً ماسياً لقطع مقاطع فائقة الرقة. ثم وبواسطة أداة رمش العين، انقل مقطعين إلى ثلاثة مقاطع من حامل الماء إلى شبكات ذات مسامية 200 mesh وضعها في طبق بتري زجاجي.انقل الطبق الذي يحتوي على الشبكات إلى صفيحة تسخين عند 30 درجة Celsius لمدة 30 دقيقة لتجفيف المقاطع. أضف قطرات من 1%uranyl acetate، ثم قم بالتحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لصبغ الشبكات. بعد ذلك، استخدم الماء المقطر للشطف من ست إلى ثماني مرات.قم بالصبغ باستخدام سترات الرصاص وفق طريقة Reynolds في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق قبل الشطف من ست إلى ثامني مرات. انقل طبق بيتري الزجاجي الذي يحتوي على الشبكات إلى لوح تسخين عند 37 درجة مئوية لتجفيف القطاعات. أخيراً، قم بتحليل القطاعات باستخدام المجهر الإلكتروني عند 87 kilovolts.تظهر هنا بتكبير منخفض مقاطع شبه رقيقة مصبوغة بصبغة التولودين الأزرق من كتل تحتوي على راسب خلوي صغير يؤكد وجود مجموعة من الخلايا. وتظهر هذه الصورة ذات التكبير الأعلى المورفولوجيا السليمة للخلايا. يمثل هذا الشكل مجال نظرة عامة لمجموعة الخلايا من مقاطع فائقة الرقة صُبغت بأسيتات اليورانيل وسيترات الرصاص وحُللت باستخدام المجهر الإلكتروني.يظهر هنا خلية جذعية مكونة للدم (HSC) واحدة، مما يثبت أن مورفولوجيا الخلايا وبنيتها الدقيقة قد تم الحفاظ عليها جيداً. وتظهر صورة مجهرية إلكترونية بتكبير أعلى وتفاصيل دقيقة لخلية جذعية مكونة للدم واحدة البنى الدقيقة داخل الخلوية. بالإضافة إلى ذلك، التقطت الصور ذات التكبير العالي بنية وسلامة العضيات تحت الخلوية المحفوظة جيداً مثل الميتوكوندريا.بمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها في غضون خمس إلى ست ساعات، أما بالنسبة لصبغ اللون الأزرق المتقدم والتضمين في الآجاروز، ومن ثم المعالجة المعتادة بالمجهر الإلكتروني النافذ (TEM)، فسيستغرق ذلك من خمسة إلى ستة أيام إذا تم تنفيذها بشكل صحيح. لذا، بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير العينات من تحضير الخلايا الحقيقية لتحليل TEM.

an-alternative-approach-for-sample-preparation-with-low-cell-number

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

نحن في هذه المقالة وصف طريقة بسيطة لحصاد واحد من الخلايا العصبية من ثقافات الجرذان الأولية واللاحقة تحليل transcriptome به آرنا التضخيم. هذا النهج هو تعميم إلى أي نوع من الخلايا.

Transcriptome تحليل خلايا مفردة

هذا البروتوكول هو لاسترداد وإعداد الخلايا الهدف نادرة من خليط مع الخلايا الخلفية غير المستهدفة لتحديد الخصائص الوراثية الجزيئية على مستوى خلية واحدة. نوعية الحمض النووي يساوي عدم تعامل الخلايا المفردة، ويسمح للتطبيق خلية واحدة (كلا الفرز على أساس وتستهدف تحليل).

الخلية الهدف الجينوم قبل التخصيب وكله التضخيم لتوصيف المصب خلية مفردة

وترد أداة وأساليب لإعداد مجلدات الحجم نانولتر عينة مجهر إلكتروني. أية خطوات ورقة النشاف مطلوبة، وبالتالي تجنب العواقب الضارة وهذا يمكن أن يكون للبروتينات، إلى حد كبير الحد من فقدان عينة وتمكين تحليل خلية مفردة ليساتي البروتيوميات البصرية.

إعداد عينة المنمنمة مجهر إلكتروني

هذا البروتوكول يصف العمليات العامة ومراقبة الجودة الشيكات اللازمة لإعداد الخلايا المفردة الثدييات الكبار صحية التحضيرات تسلسل الحمض النووي الريبي في خلية مفردة المستندة إلى الحبرية، وارتفاع الإنتاجية. ترتيب المعلمات، محاذاة قراءة وتحليل المصب خلية واحدة bioinformatic تتوفر أيضا.

ترانسكريبتوميكس خلية واحدة على أساس المتوازية الحبرية من أنسجة الثدييات الكبار

يصف هذا البروتوكول طريقة الخلية الواحدة للتحليلات فوق الجينية التكرارية باستخدام خلية مفردة قابلة لإعادة الاستخدام. تسمح الخلية المفردة القابلة لإعادة الاستخدام بتحليل العلامات اللاجينية المتعددة في نفس الخلية المفردة والتحقق الإحصائي من النتائج.

خلية مفردة قابلة لإعادة الاستخدام للتحليلات الجينومية التكرارية

تبشر جدوى وفعالية طرق scRNA-seq عالية الإنتاجية بعصر الخلية الواحدة في أبحاث النبات. يظهر هنا إجراء قوي وكامل لعزل أنواع معينة من خلايا جذر Arabidopsis thaliana وبناء مكتبة النسخ اللاحقة وتحليلها.

عزل وتحليل النسخ لأنواع الخلايا النباتية

يوفر هذا البروتوكول إجراء تحضيرا محسنا ومتقنا لعينات الشبكية العضوية للمجهر الإلكتروني النافذ. وهي مناسبة للتطبيقات التي تنطوي على تحليل نقاط الاشتباك العصبي في عضويات الشبكية الناضجة.

تحضير عينات الشبكية العضوية للمجهر الإلكتروني النافذ

يحدد هذا البروتوكول الإجراء الخاص بالفصل السريع لعينات ورم الإنسان والفأر لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.

تفكك عينات أنسجة ورم الإنسان والفأر لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية

يقدم هذا البروتوكول طريقة عملية باستخدام Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) كمثال لمعالجة التوزيع غير المتكافئ للجسيمات من خلال تحسين تحضير العينة ، مما يوفر مرجعا للباحثين لتوضيح الهياكل الجزيئية بكفاءة باستخدام المجهر الإلكتروني المبرد (cryo-EM).

تحسين تحضير العينة للفحص المجهري الإلكتروني المبرد

هنا، نقدم بروتوكولا لأتمتة تحليل التعديل بعد الترجمة للهيستون أحادي الخلية باستخدام استراتيجية وسم ثنائي النظائر وهضم ArgC. يتيح هذا السير من التحليل الكمي والقابل للتكرار وعالي الحساسية لتغاير الكروماتين والاستجابات فوق الجينية بدقة خلية واحدة.

تحضير العينات الآلي للتحليل متعدد الخلية لتعديلات ما بعد الترجمة على الهيستون أحادي الخلية (sc-hPTM2)

تعلم طريقة إعداد عينات ذات عدد خلايا منخفض لتحليل المجهر الإلكتروني النافذ، باستخدام 10,000 خلية جذعية نقوية. هذه التقنية توفر نتائج نوعية وكمية موثوقة في سياق فسيولوجي حقيقي.

طريقة بديلة لإعداد نموذج مع انخفاض عدد الخلايا لتحليل تيم

استكشف المزيد من الفيديوهات