طريقة بديلة لإعداد نموذج مع انخفاض عدد الخلايا لتحليل تيم

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعداد عينات ذات أعداد خلايا منخفضة لإجراء تحليل TEM بطريقة فعالة وقابلة للتكرار. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الكشف عن جميع هياكل الخلايا الحقيقية وإعدادات فسيولوجية أفضل في المجال الطبي الحيوي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن الحصول على نتائج نوعية وكمية من أعداد الخلايا المنخفضة بطريقة قابلة للتكرار.

للبدء ، استخدم الحقائق لفرز 10،000 خلية جذعية مكونة للدم ، أو HSC في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. تحتوي على 600 ميكرولتر من وسط دولبيكو المعدل مع 10٪ FBS. باستخدام جهاز طرد مركزي مع دلاء متأرجحة للخارج ، قم بتدوير HSC المرتبة عند 1،000 مرة G لمدة 10 دقائق.

استخدم الشفط الجندي لإزالة كل ما عدا 200 ميكرولتر من الوسط. لإصلاح الخلايا ، أضف 0.2 مل من محلول مثبت X محضر حديثا ، واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، أضف 600 ميكرولتر من 0.1 مولار كاكوديلات عازلة لغسل الخلايا.

الطرد المركزي للخلايا مرة أخرى ، هذه المرة عند 30 درجة مئوية. ثم بعد الطرد المركزي ، وإزالة جميع السعة العازلة باستثناء 200 ميكرولتر ، أضف 200 ميكرولتر من ملليغرامين لكل مليلتر من إيفانز الأزرق في عازلة كاكوديلات ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لتلطيخ الخلايا. استخدم 600 ميكرولتر من 0.1 مولار كاكوديلات عازلة لغسل الخلايا ثلاث مرات.

ثم أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر المتبقية من المخزن المؤقت قبل نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 0.5 مل. في هذه الخطوة ، يجب أن تكون الحبيبات مرئية في الأنبوب. باستخدام جهاز طرد مركزي على سطح الطاولة ، قم بتدوير الخلايا عند 1 ، 000 مرة جم لمدة 10 دقائق.

ثم قم بإزالة المخزن المؤقت برفق دون إزعاج حبيبات الخلية الصغيرة المرئية الآن ، مع ترك 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت في الأنبوب. قم بإعداد محلول الاغاروز بنسبة 4٪ ، عن طريق إضافة 200 ملليغرام من الاغاروز منخفض الذوبان إلى خمسة ملليلتر من 0.1 مولي كاكوديلات في أنبوب 15 مل. قم بإذابة الاغاروز عن طريق نقل الأنبوب إلى الماء المغلي في زجاجة زجاجية سعة 100 مل.

أضف 200 ميكرولتر من محلول الاغاروز إلى أنبوب تعليق الخلية. جهاز طرد مركزي على الفور عند 1 ، 000 مرة جم ، و 30 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد التأكد من أن الخلايا التي تم تكويبها في الاغاروز شبه الصلب في قاع الأنبوب ، انقل الأنبوب على الفور إلى أربع درجات مئوية ، أو الجليد ، لمدة 20 دقيقة لتصلب الاغاروز.

باستخدام إبرة قياس 27 ، انقل بعناية الاغاروز المتصلب ، الذي يحتوي على حبيبات الخلية ، إلى طبق بتري بلاستيكي سعة 35 مل يحتوي على 0.1 مولار كاكوديلات عازلة. باستخدام تقليم مشرط ، فإن الاغاروز المتصلب الذي يحتوي على حبيبات الخلية في قطعة واحدة من حوالي ملليمتر إلى ملليمترين. ثم انقله إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل.

أضف 600 ميكرولتر من محلول cacodylate 0.1 مولار واغسل حبيبات خلية الاغاروز باستخدام ماصة لإضافة المخزن المؤقت وإزالته. قم بإزالة المخزن المؤقت من حبيبات خلية الاغاروز وفي غطاء الدخان ، أثناء ارتداء الملابس والقفازات الواقية ، أضف ملليلتر واحد من محلول رابع أكسيد الأوزميوم 1٪. احتضان حبيبات الخلية عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.

بعد الحضانة ، اغسل العينة ثلاث مرات. انقله إلى قارورة زجاجية سعة 20 مل بغطاء. بعد ذلك ، قم بتجفيف العينة باستخدام سلسلة الإيثانول.

ثم تسلل العينة بتركيزات متزايدة من راتنج LX 112 في الإيثانول قبل احتضانها في راتنج 100٪ مرتين لمدة 60 دقيقة في كل مرة. باستخدام الملقط ، انقل العينة بعناية إلى أسفل قالب مطاطي على شكل طرف هرمي ، وأضف راتينجا نقيا أعلى العينة لملء القالب. احتضان العينة عند 60 درجة مئوية لمدة 72 ساعة لبلمرة الراتنج.

عندما يتم بلمرة الراتنج ، قم بإزالته من القوالب عن طريق لف القالب المطاطي. يجب أن تكون مجموعة سوداء صغيرة من الخلايا مرئية في هرم الراتنج المبلمر. استخدم سيانواكريليت لربط هرم الراتنج المبلمر بأسطوانة تثبيت للتقسيم.

بعد تركيب الكتلة على ميكروتوم فائق الصغر ، استخدم شفرة حلاقة وسكين ماسي لتقليم الكتلة الهرمية ، مما يجعل شكل شبه منحرف قصير وعريض مع الجزء العلوي والسفلي من الكتلة موازية لبعضهما البعض ، وبجوانب بزاوية متساوية. ثم استخدم السكين الماسي لتقليم الكتلة حول حبيبات الخلية وإزالة الأجزاء البلاستيكية حول قطعة الاغاروز بيليه الخلية. باستخدام الميكروتوم الفائق ، قم بقطع أقسام ميكرومتر واحد واستخدم أداة رمش وحلقة معدنية لنقل الأقسام من القارب المائي إلى شريحة زجاجية.

ثم ضع الشرائح على طبق ساخن عند 37 درجة مئوية حتى تجف. باستخدام حقنة بفلتر 0.22 ميكرومتر ، أضف قطرة من محلول التيلواتين الأزرق إلى الأقسام واحتضانها لمدة ثلاث دقائق. ثم بالماء المقطر ، ارفع الشرائح واترك الأقسام تجف.

بعد التجفيف ، تحقق من الأقسام الموجودة تحت المجهر الضوئي لتحديد موضع الخلايا. بعد ذلك ، استخدم سكينا ماسيا لقطع أقسام رفيعة جدا. ثم باستخدام أداة رمش ، انقل قسمين إلى ثلاثة أقسام على 200 شبكة شبكية من القارب المائي وضعها في طبق بتري زجاجي.

انقل الطبق مع الشبكات إلى طبق ساخن على حرارة 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتجفيف الأقسام. أضف قطرات من أسيتات اليورانيل بنسبة 1٪ ، واحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لتلطيخ الشبكات. ثم استخدم الماء المقطر للشطف من ست إلى ثماني مرات.

وصمة عار مع سترات الرصاص رينولدز في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق قبل شطفها من ست إلى ثماني مرات. انقل طبق بتري الزجاجي الذي يحتوي على الشبكات إلى طبق ساخن عند 37 درجة مئوية لتجفيف الأقسام. أخيرا ، قم بتحليل الأقسام بالمجهر الإلكتروني عند 87 كيلو فولت.

تظهر هنا عند التكبير المنخفض أقسام شبه رقيقة ملطخة باللون الأزرق تولويدين من كتل تحتوي على حبيبات خلية صغيرة تؤكد مجموعة من الخلايا. تظهر صورة التكبير الأعلى هذه التشكل السليم للخلايا. يمثل هذا الشكل مجال رؤية علوي لمجموعة الخلايا من أقسام رقيقة جدا ملطخة بخلات اليورانيل وسيترات الرصاص وتم تحليلها باستخدام المجهر الإلكتروني.

يظهر هنا HSC واحد ، مما يدل على أن التشكل والبنية الفائقة للخلايا قد تم الحفاظ عليها جيدا. يظهر الرسم المجهري الإلكتروني عالي التكبير عالي التفصيل ل HSC الفردي الهياكل الفائقة داخل الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، التقطت صور التكبير العالية بنية وسلامة العضيات تحت الخلوية المحفوظة جيدا مثل الميتوكوندريا.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون خمس إلى ست ساعات ، وللتلوين الأزرق المتقدم ، وتضمين الاغاروز ، ومن ثم تستغرق معالجة TEM العادية من خمسة إلى ستة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. لذلك بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يكون لديك نوع من الفهم الجيد لكيفية تحضير عينات من إعداد الخلايا الحقيقي لتحليل TEM.