نموذج في المختبر لدراسة التحول الخلوي من هربس كابوزي ساركوما

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعداد وهمية متطابقة مع العمر والمرور في الخلايا البطانية المصابة ب KSHV لتمكين دراسة التغيرات المرتبطة ب KSHV في التعبير الجيني للخلية المضيفة بما في ذلك التغيرات التي تؤدي إلى التحول الخبيث في سياق الضوابط المناسبة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تحديد التغيرات الفيزيولوجية المرضية الرئيسية في بيولوجيا الخلية المضيفة التي تؤدي إلى السرطانات المرتبطة ب KSHV ، وبالتالي تحديد أهداف علاجية جديدة للوقاية من الأمراض أو علاجها. الميزة الرئيسية لهذا النظام هي أن التحول الخبيث للخلايا البطانية بعد الإصابة ب KSHV يحدث بسرعة وبشكل متكرر مما يسمح بدراسة الأحداث المبكرة في عملية الأورام مع خلايا التحكم المتطابقة مع العمر والممر.

على الرغم من أن هذا النموذج من تكوين الأورام الفيروسي يمكن أن يوفر نظرة ثاقبة لتطور ساركوما كابوسي ، إلا أنه يمكن تطبيقه أيضا على أنواع السرطان الأخرى. نظرا لأن ساركوما كابوسي هي ورم وعائي ، فإن الآثار المترتبة على نموذج زراعة الخلايا هذا تمتد نحو فهم عمليات المرض الأخرى التي يحركها تكوين الأوعية الدموية المرضية. للبدء ، قم بإعداد وتصفية مخزن TNE المعقم كما هو موضح في بروتوكول النص.

ثم قم بتخزين المحلول عند أربع درجات مئوية. استزراع خط خلايا سرطان الغدد الليمفاوية الانصباب الأولي السلبي KSHV الإيجابي BCBL-1 في قارورة T150 مملوءة ب 60 مل من وسط RPMI. حافظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية 5٪ ثاني أكسيد الكربون للحصول على تعليق من 1 إلى 1.2 مرة تقريبا 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر.

بمجرد الوصول إلى الكثافة المناسبة ، قم بتقسيم الخلايا من واحد إلى اثنين بوسط جديد وأضف PMA إلى التركيز النهائي البالغ 20 نانوغرام لكل مليلتر للحث على إنتاج KSHV. ثم احتضان الثقافات لمدة خمسة أيام. بعد خمسة أيام من الحضانة ، قم بحصاد الجزيئات الفيروسية عن طريق تدوير معلقات الخلية عند 300 مرة جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

ثم انقل المواد الطفية إلى أنبوب جديد. الطرد المركزي للطاقات الطافية مرة أخرى عند 2 ، 500 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق لإزالة الحطام الخلوي. الآن بعد أن تم توضيحه ، قم بتراكب خمسة ملليلتر من محلول السكروز بنسبة 25٪ في TNE مع ما يقرب من 30 مل من المادة الطافية في ستة أنابيب للطرد المركزي الفائق.

الطرد المركزي الأنابيب المتوازنة عند 75 ، 000 مرة جم لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية تحت الفراغ. بمجرد اكتمال الطرد المركزي ، قم بصب المادة الطافية وصمة عار حافة كل أنبوب لإزالة أكبر قدر ممكن من السائل. ثم قم بتعليق الفيروس المحبب في 150 ميكرولتر من مخزن TNE المؤقت وقم بتجميع جميع العينات.

امزج التعليق المجمع جيدا وقسمه إلى 25 ميكرولتر. قم بتخزين فيروس المخزون عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. زراعة الخلايا البطانية الجلدية أو الليمفاوية الأولية للبشرية في وسط EGM في قارورة T75.

الحفاظ على زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى الوصول إلى التقاء 50٪ تقريبا. قبل نقل الخلايا البطانية ، استزراع خلايا PA317 LXSN 16E6E7 في قارورة ثقافة خلية T150 مملوءة ب 20 مل من DMEM عند 37 درجة مئوية 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بمجرد تحقيق التقاء 90٪ تقريبا ، استبدل الوسط من ثقافة الخلايا PA317 ب 16 مل من الوسط الطازج واحتضان الخلايا طوال الليل.

بعد الحضانة الليلية ، اجمع الوسط من ثقافة الخلايا PA317 وقم بتوضيحه عن طريق الطرد المركزي عند 300 مرة جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. استبدل وسط EGM من 50٪ ثقافة الخلايا البطانية المتقاربة ب 12 مل من وسط PA317 المصفى. احتضان الخلايا لمدة أربع ساعات.

ثم استبدل ستة ملليلتر من وسط PA317 بستة ملليلتر من وسط EGM الطازج واحتضان الخلايا طوال الليل. بعد ذلك ، قم بإزالة الوسط من ثقافة الخلايا البطانية وقم بتغذية الخلايا ب 12 مل من EGM الطازج. استمر في احتضان الخلايا لمدة 48 ساعة إضافية.

لزراعة الخلايا البطانية الفرعية ، قم بإزالة الوسط وغسل الخلايا ب 12 مل من PBS الخالي من الكاتيون. ثم أضف ثلاثة ملليلتر من محلول التفكك الأنزيمي التجاري واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. انقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر وقم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 مرة جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بمجرد تكوير الخلايا ، أعد تعليق الخلايا في وسط EGM جديد وقسم التعليق بالتساوي إلى ثلاث قوارير T75. اضبط حجم الثقافات على 12 مل من EGM لكل قارورة. ثم أضف 200 ميكروغرام لكل مليلتر من G418 لتحديد الخلايا البطانية المنقولة.

حصاد الخلايا البطانية المنقولة عن طريق الهضم الأنزيمي كما هو موضح سابقا. أعد تعليق حبيبات الخلية البطانية في مليلتر واحد من وسط EGM. ثم امزج خمسة ميكرولترات من معلق الخلية مع 45 ميكرولترا من محلول التريبان الأزرق وعد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس كثافة الدم.

البذور 2.5 في 10 إلى الخلايا الخامسة القابلة للحياة في ملليلترين من وسط EGM لكل بئر من صفيحة من ستة آبار. في اليوم التالي ، قم بإزالة وسط EGM واغسل الخلايا في كل بئر بثلاثة ملليلتر من PBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم. ثم أضف ملليلترين من وسط EBM إلى كل بئر.

لإصابة الخلايا ب KSHV ، أضف خمسة إلى 20 ميكرولترا من مخزون الفيروس إلى كل بئر وقم بتدوير اللوحة لخلط المعلقات. أضف حجما متساويا من المخزن المؤقت TNE إلى كل بئر يحتوي على خلايا مصابة بهمية. بعد الطرد المركزي للوحة عند 400 مرة جم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، قم باحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.

ثم أضف ملليلترين من وسط EGM إلى كل بئر واحتضان الثقافات بين عشية وضحاها. بعد الحضانة ، قم بإزالة وسط EGM من كل بئر واستبدله بملليلترين من EGM الطازج. عندما تصل الخلايا إلى ما يقرب من 90٪ من التقاء ، قم بحصادها عن طريق الهضم الأنزيمي كما هو موضح سابقا.

قم بتجميع الخلايا من ثلاثة آبار في قارورة T75 مكتوب عليها بعدد الممرات الإجمالية في الممر بعد الإصابة. قبل الاختبار أو التجميد ، قم بتوسيع مزارع الخلايا البطانية الوهمية والمصابة ب KSHV عن طريق تقسيمها من واحد إلى ثلاثة لممرين إضافيين على الأقل. معروضة هنا صورة مجهرية للخلايا البطانية المصابة بالوهمية المتقاربة تكشف عن مظهر مرصوف بالحصى كلاسيكي.

يتم تثبيط الانقسام الخلوي في هذه الخلايا عند ملامسته عندما تصل الثقافة إلى التقاء. تطور الخلايا البطانية المصابة ب KSHV مورفولوجيا ممدودة تشبه المغزل تذكرنا بخلايا مغزل Kaposi Sarcoma. على عكس الخلايا المصابة ب وهمية ، تستمر الخلايا البطانية المصابة ب KSHV في التكاثر حتى عندما تصل إلى التقاء مما يؤدي إلى تطوير بؤر خلوية متعددة الطبقات.

عند فقدان الاتصال بالركيزة ، تخضع الخلايا البطانية المصابة بالصخور لموت الخلايا المبرمج ، anoikis ، بالإضافة إلى أنها لا تشكل مستعمرات في أجار ناعم. على العكس من ذلك ، فإن الخلايا المصابة ب KSHV تقاوم الأنويكيس والمستعمرات النامية عند زراعتها في أجار ناعم. يصاحب تطور مورفولوجيا المغزل على شكل مغزل في الخلايا البطانية المصابة ب KSHV التعبير عن بروتين الكمون الفيروسي ORF73 وبدرجة أقل عامل المعالجة الفيروسية ORF59.

عند الإصابة ب KSHV BAC16 الموسومة ببروتين فلوري أخضر ، طورت الخلايا البطانية مورفولوجيا على شكل مغزل وتظهر تعبير GFP مما يؤكد العلاقة غير الرسمية بين عدوى KSHV في النمط الظاهري المرصود. بعد تطويره ، مهد نموذج زراعة الخلايا هذا الطريق للباحثين لتقييم التغيرات في mRNA للخلية المضيفة وتعبير البروتين الناجم عن عدوى KSHV. وبالتالي ، تم تحديد الآليات المسببة للأمراض الرئيسية الكامنة وراء تكوين الأورام بوساطة KSHV والتي تمثل أهدافا علاجية واعدة.

لا تنس أن KSHV هو عامل BSL-2 ويجب التعامل معه من خلال إجراءات وممارسات احتواء السلامة البيولوجية المناسبة.