Name: نموذج في المختبر لدراسة التحول الخلوي من هربس كابوزي ساركوما (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: استكشف نموذج الخلايا البطانية المصابة بفيروس KSHV لدراسة التحول الخبيث في ساركوما كابوزي. يتيح هذا النظام تحليل التغيرات الجينية المبكرة وتحديد أهداف علاجية جديدة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل قبل HD068322 K12 (SCM)؛ R01 CA179921 و P51 OD011092 للمركبات؛ وجائزة 14PRE20320014 من جمعية القلب الأمريكية (س. ب).

ملاحظة: ينبغي إجراء جميع الإجراءات المبينة في هذا البروتوكول في ظروف BSL-2-
 1-"إعداد الأوراق المالية كشف" <ol><li>TNE إعداد المخزن المؤقت: حل ملغ 292.24 يدتا في ddH 2 س وتقديمهم إلى 225 مل، وضبط لدرجة الحموضة 8. حل ملغ 605.7 تريس في ddH 2 س وتقديمهم إلى 225 مل، وضبط لدرجة الحموضة 8. الجمع بين الحلول يدتا وتريس، إضافة ز 4.38 كلوريد الصوديوم، ضبط الحجم النهائي إلى 500 مل، وتصفية تعقيم، وتخزينها في 4 درجات مئوية .</li>
	<li>الثقافة كشف الإيجابية، السلبية EBV انصباب الابتدائي سرطان الغدد الليمفاوية الخلية خط BCBL-1 في حاضنة هوميديفيد في 37 درجة مئوية بالإضافة إلى 5% CO 2 في ربمي تستكمل مع 10% معطل الحرارة الجنيني البقري المصل (FBS) ومضادات الميكروبات إلى حوالي 1 1.2 × 10 6 خلايا كل مل.</li>
	<li>للحث على كشف الإنتاج، تقسيم الثقافات 1:2 مع متوسطة جديدة وإضافة Phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) بتركيز نهائي من 20 نانوغرام/مليلتر واحتضان الثقافات لمدة 5 أيام. وكبديل لذلك، يعامل الخلايا مع بوتيرات الصوديوم (قبض؛ 0.1 ملم) لمدة 3 أيام للحث على النسخ المتماثل الفيروسية الحال.</li>
	<li>حصاد الجسيمات الفيروسية، الطرد المركزي أولاً ثقافة طافية على 300 غرام x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لبيليه الخلايا ونقل سوبيرناتانتس إلى أنابيب جديدة.</li>
	<li>لزيادة توضيح المادة طافية لتجنب نقل الحطام الخلوية، الطرد المركزي في 2,500 س ز لمدة 10 دقائق في 4 ° C. 
	ملاحظة: كبديل للطرد المركزي عالية السرعة توضيحاً لثقافة سوبيرناتانتس، الترشيح عن طريق 0.45 عقيمة يمكن إجراء تصفية ميكرومتر. وقد لاحظنا انخفاض ملحوظ في عيار استخدام الترشيح؛ ولذلك، نقوم بشكل روتيني الطرد المركزي والخطوة الثانية بدلاً من ذلك.</li>
	<li>المقبل، تراكب 5 مل محلول السكروز 25% في المخزن المؤقت TNE مع حوالي 30 مل ثقافة أوضح طافية في أنابيب أولتراسينتريفوجي 6-</li>
	<li>الطرد المركزي موازنة الأنابيب في 75,000 س ز 2 ح في 4 درجات مئوية تحت الفراغ.</li>
	<li>صب الثقافة طافية ولطخة حافة كل أنبوبة لإزالة قدر حل المادة طافية والسكروز قدر الإمكان، ثم ريسوسبيند بيليه الفيروسات، التي قد لا تكون مرئية في 150 ميليلتر من المخزن المؤقت TNE.</li>
	<li>تجمع كل حراكه الفيروس، يخلط جيدا، وتجميد 25 ميليلتر مختبرين في-80 درجة مئوية .</li>
</ol> 2. توصيل من المفوضية الأوروبية مع E6 و E7 جينات فيروس الورم الحليمي ملاحظة: نستخدم قوارير زراعة الأنسجة القياسية بشكل روتيني لزراعة الأولية الجماعة الأوروبية. ومع ذلك، إذا كان يتم الحصول على النمو غير مرضية من المفوضية الأوروبية ثم استخدام قوارير الثقافة التجارية ينبغي النظر.
<ol><li>الثقافة الأولية البشرية عن طريق الجلد microvascular أو اللمفاوية المفوضية الأوروبية في حاضنة هوميديفيد في 37 درجة مئوية بالإضافة إلى 5% CO 2 في الجماعة الأوروبية النمو المتوسطة (EGM؛ يحتوي على المفوضية الأوروبية المتوسطة القاعدية [EBM] تستكمل مع "بوليتكيت" EGM-2 [تحتوي على FBS، الهيدروكورتيزون وعامل النمو تنتجها الخلايا الليفية البشرية-ب وعامل نمو الأوعية الدموية في المفوضية الأوروبية، مثل الأنسولين عامل النمو-1، حمض الأسكوربيك، البشرية عامل النمو الظهارية، والمضادات الحيوية والهيبارين]) في قارورة ثقافة خلية T75 إلى ما يقرب من 50% التقاء.</li>
	<li>لتوصيل، خلايا الثقافة لكسسن PA317 16E6E7 24 ، 35 في حاضنة هوميديفيد في 37 درجة مئوية بالإضافة إلى 5% CO 2 في دميم وتستكمل مع 10% FBS ومضادات الميكروبات في T150 خلية ثقافة قارورة حتى هم روافد 90% تقريبا. ثم احتضانها بين عشية وضحاها في 16 مل متوسطة.</li>
	<li>توضيح المتوسطة PA317 من سينتريفوجينج على 300 غرام x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة-</li>
	<li>إزالة اجتماع فريق الخبراء من الخلايا الثقافة وتراكب المفوضية الأوروبية مع 12 مل الوسط PA317 أوضح واحتضانها ل 4 h. 
	ملاحظة: سينتريفوجينج 16 مل متوسطة مكيفة على 300 غرام x لنتائج دقيقة 5 في بيليه مدمجة التي لا تشعر بالقلق إزاء إزالة اللاحقة حذراً من 12 مل لتوضيح المادة طافية. ومع ذلك، إذا نقل الخلايا 16E6E7 لكسسن PA317 إلى الابتدائي EC الثقافات مصدر قلق (خط خلية التعبئة والتغليف وسوف تتفوق بسرعة المفوضية الأوروبية)، ثم الترشيح من المادة طافية مكيفة من خلال عامل تصفية 0.45 ميكرومتر قبل نقل يمكن تنفيذ-</li>
	<li>استبدال 6 مل الوسط PA317 EGM الطازجة واحتضان بين عشية وضحاها.</li>
	<li>"ريفيد المفوضية الأوروبية" مع 12 مل EGM الطازجة واحتضان h. 48 مزيد من</li>
	<li>بدون ثقافة الجماعة الأوروبية، إزالة المتوسطة ويغسل مع 12 مل من برنامج تلفزيوني دون الكاتيونات، وأضف 3 مل حل الانفصال الانزيمية التجارية (مثلاً، تريبل) واحتضانها في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 3</li>
	نقل تعليق خلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل <li>والطرد المركزي في ز 300 x لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ريسوسبيند بيليه الخلية الناتجة في EGM الطازجة وتقسم بالتساوي إلى 3 قوارير x T75 مع وحدة تخزين نهائي لمل 12 اجتماع فريق الخبراء في قارورة.</li>
	<li>لتحديد للجماعة الأوروبية ترانسدوسيد مع E6 و E7، إضافة G418 إلى تركيز نهائي 200 ميكروغرام/مل للممرات اثنين، يمكن بعدها مطلي للإصابة أو تجميدها في نيتروجين سائل الجماعة الأوروبية ترانسدوسيد-</li>
</ol> 3. العدوى "الجماعة الأوروبية ترانسدوسيد" بكشف <ol><li>في اليوم الذي يسبق الإصابة بحصاد المفوضية الأوروبية بالهضم الأنزيمي باستخدام الحل الانفصال الانزيمية التجارية كما هو موضح أعلاه. ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من اجتماع فريق الخبراء. استخدام 5 ميليلتر من الخلايا لتحضير 1/10 إضعاف في تريبان الأزرق. عد الخلايا الحية باستخدام هيموسيتوميتير والبذور 2.5 × 10 5 خلايا حية في 2 مل من اجتماع فريق الخبراء في بئر في 6 لوحات جيدا.</li>
	<li>اليوم من العدوى، إزالة EGM وتغسل الخلايا مع 3 مل من برنامج تلفزيوني مع الكالسيوم والمغنيسيوم في البئر، وثم إضافة 2 مل EBM. 
	ملاحظة: من الضروري استخدام EBM بدلاً من اجتماع فريق الخبراء خلال العدوى، كما سوف تمنع الهيبارين في EGM ملزمة جسيمات الفيروسية والإصابة اللاحقة بهدف الجماعة الأوروبية.</li>
	إضافة الأسهم فيروس ميليلتر 5 إلى 20 لكل بئر <li>لتصيب الخلايا مع كشف، ودوامه لوح لمزج. لإضافة الخلايا المصابة وهمية بحجم المخزن المؤقت TNE متساوية لكل بئر.</li>
	<li>الطرد المركزي لوحات في 400 غ س لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة واحتضان ثم اللوحات في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 90</li>
	<li>إذا كان الهدف من هذه الدراسة التحقيق في الأحداث المبكرة التي تتطلب متزامن التهاب فيروسي، مثلاً، الأحداث المبكرة في حيثياته العدوى، إزالة العدوى الفيروسية عند هذه النقطة. شطف وريفيد الخلايا مع 2 مل EGM الطازجة. وبخلاف ذلك، إضافة 2 مل EGM واحتضان الثقافات بين عشية وضحاها.</li>
	<li>ريفيد الخلايا مع 2 مل EGM اليوم بعد الإصابة وبعد ذلك مرة كل يومين-</li>
	<li>عندما تكون الخلايا حوالي 90% روافد، حصادها بالهضم الأنزيمي باستخدام الحل الانفصال الانزيمية التجارية كما هو موضح أعلاه، ثم تجمع الخلايا من ثلاثة آبار في T75، مشيراً إلى عدد إجمالي المرور ومرور ما بعد الإصابة.</li>
	قم بتوسيع <li>وهمية وكشف-المصابين بالمفوضية الأوروبية مع تقسيمات 1:3 للممرات أكثر اثنين على الأقل في الوقت الذي يمكن استخدامه في تجارب الخلايا أو تجميدها في نيتروجين سائل. 
	ملاحظة: كما هو الحال مع تقسيم للجماعة الأوروبية ترانسدوسيد مع E6 و E7، صون الثقافات من الخلايا المصابة وهمية وكشف يجب تقسيمها قبل التوصل إلى التقاء (~ 85 إلى 90%).</li></ol>
 4. "تأكيد الإصابة" بكشف طريق الفلورة ملاحظة: الكشف كشف الكمون المرتبطة النووية مستضد (LANA-1/ORF73) يوفر مقياس كمي موثوق للعدوى. الأجسام المضادة-LANA متوفرة تجارياً.
<ol><li>في اليوم السابق لتلطيخ، آبار لوحة اثنين كل منهما مع موك-كشف-إصابة أو الجماعة الأوروبية على لوحة 24-جيدا في 1 × 10 5 خلايا كل جيدا في 1 مل EGM واحتضان بين عشية وضحاها.</li>
	<li>الخلايا يغسل مرتين مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى الكالسيوم وماجنيسيوم. أغسل لمدة 30 ثانية على منصة هزاز.</li>
	<li>في غطاء دخان خارجياً-فينتيلاتيد، إصلاح الخلايا مع 500 ميليلتر من بارافورمالدهيد 4% لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-</li>
	<li>يغسل خلايا ثلاث مرات مع 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (0.1% X-100 تريتون زائد مصل الماعز 0.02 في المائة في برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى الاتصالات)-</li>
	<li>كتلة الخلايا مع 500 ميليلتر من مصل الماعز 2% في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-</li>
	<li>يغسل خلايا ثلاث مرات مع 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي-</li>
	<li>تسمية بئر واحدة من موك-كشف-إصابة أو تضعف الجماعة الأوروبية مع 200 ميليلتر من جسم الابتدائي 01:100 في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على الروك. احتضان بئرين المتبقية في 200 ميليلتر من المخزن المؤقت للغسيل فقط.</li>
	<li>يغسل خلايا ثلاث مرات مع 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي-</li>
	<li>تسمية جميع الآبار الأربعة مع 200 ميليلتر من جسم الثانوي المخفف 1: 100 في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على الروك.</li>
	<li>يغسل خلايا ثلاث مرات مع 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي-</li>
	<li>لكل بئر تطبيق 20 ميليلتر من تصاعد DAPI تحتوي على المتوسط وساترة وتقييم التلوين باستخدام مجهر فلوري مقلوب.</li>
	<li>تحديد نسبة العدوى من الخلايا المصابة بكشف عن طريق العد عدد الأنوية LANA إيجابية في الخلايا على الأقل 200. العدوى مع المؤتلف يمكن أيضا رصد كشف Bac16 عن طريق مراقبة ثقافات للتعبير عن التجارة والنقل-</li>
</ol>

أونكوجينيسيس هو عملية متعددة الخطوات التي تلتف ضمانات هامة داخل الكائن حي36. نظراً لعدم وجود آفات KS على طول طائفة التهاب مزمن الطويلا صحيح، يتطلب توضيح بعض العمليات الفيزيولوجية المرضية بكشف وساطة إجراء بعض الدراسات في نماذج الثقافة الخلية التي تدعم التحول9. تجدر الإشارة إلى أن فقدان الاتصال تثبيط ومرسى-تعتمد على النمو، تعمل يدل على التحول الخلوي، لا تتطور سهولة عقب العدوى الأولية الجماعة الأوروبية أو EC خلد خارجية التعبير عن تيلوميراسي. ولذلك، بينما لا الخص النموذجية ...

ساركوما كابوزي (KS) هو ورم أنجيوبروليفيراتيفي تنسيق المتعددة التي تؤثر على المواقع عن طريق الجلد والأغشية المخاطية الحشوي أن يطور الأكثر شيوعاً في الإعداد لقمع المناعة المتقدم1. وقد وصف النماذج الوبائية الأربعة: الكلاسيكية، وشكل من أشكال كسول عادة ما تؤثر على كبار السن من تراث البحر الأبيض المتوسط والشرق الأوسط؛ علاجية المنشأ، الناجمة عن المعالجة بالأدوية المثبطة للمناعة بعد زرع الأعضاء؛ هذا الوباء، تعريف الإيدز مرض سرطان؛ والمتوطنة، شكلاً مستقلاً عن فيروس نقص المناعة البشرية مشتركة في الأطفال في المناطق الموبوءة في أفريقيا. ومع ظهور أنظمة العقاقير المضادة للفيروسات الرجعية تركيبة فعالة لعلاج فيروس نقص المناعة البشرية، أقل بكثير عادة يتم تشخيص KS الوباء في البلدان النامية. ومع ذلك، تظل النماذج العدوانية سريرياً المتوطنة والوبائية بين الأكثر شيوعاً تشخيص السرطان في العديد من البلدان الأفريقية2،،من34. ولذلك، يعتبر تحديد أدوية فعالة تستهدف المرضية لعلاج كانساس أولوية بحثية.
الأشيع، تتميز الآفات KS neovascularization واسعة النطاق ولكن غير طبيعية حيث تشكل المغزل خلايا المنشأ الأوروبية شبكات الأوعية الدموية متقطع5. تسمح هذه السفن غير طبيعي ("الشقوق الأوعية الدموية") التسرب من الكريات الحمراء، التي تعطي الآفات لون مميز. بالإضافة إلى ذلك، تتضمن الآفات الكريات البيضاء العديدة التي تميز الالتهاب المزمن (أي الخلايا الليمفاوية والضامة وخلايا البلازما). لقد وصف انحدار آفات كانساس بعد إعادة تشكيل المناعة، مما يوحي بأن سمات KS آفة فرط التكاثري وورم حقيقي6،،من78،9.
KS هربس (كشف)، المسبّب كانساس، حددت في عام 199410. منذ آنذاك كثيرة في المختبر خلية الثقافة-تم تطوير نماذج لتمكين الدراسات المرضية، بما في ذلك الخلايا اكسبلانتيد من المواد خزعة الورم والابتدائية أو المفوضية الأوروبية تعرب عن تيلوميراسي المصابين بكشف في المختبر11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18-أي من النماذج المتاحة حاليا ويجمل كانساس وورم المكروية تماما، ولكن جميعا أسهمت بمعرفة قيمة لفهم بل لكشف العدوى. خلافا الأخرى المعروفة ورمي الإنسان هربس فيروس ابشتاين-بار (EBV)، كشف عدم سهولة تحويل الخلايا في الثقافة عقب حيثياته العدوى19،،من2021، 22. ومع ذلك، تم التغلب على هذا القيد من ترانسدوسينج EC البشرية الأولية أما مختلطة الأصل ميكروفاسكولار أو اللمفاوية مع E6 واكتب E7 جينات من فيروس الورم الحليمي البشري 16 قبل الإصابة بكشف23،24 . التعبير عن هذه المسرطنة خارجية يزيد بشكل كبير احتمال تحويل لكشف في المختبر جزئيا بإتاحة المزيد من تثبيط الشبكية البروتين و p5323،24. أتاح هذا الأسلوب توصيل المفوضية الأوروبية مختبرات متعددة لتحديد التعديلات الرئيسية في المضيف التعبير الجيني في الخلايا التي هي الناجمة عن كشف العدوى والتي تظهر لتسهيل KS خلية البقاء على قيد الحياة وانتشار25،26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32-البروتوكولات المبينة في هذا التقرير مباشرة واستنساخه بدرجة عالية، وسوف تسفر عن توليد العمر ومرور مطابقة المفوضية الأوروبية كشف المصابين والمصابات موك عناصر التحكم التي يمكن أن يكون مثقف لأطول بكثير من الخلايا الأولية وسوف السماح بالتحقيق في آليات النمطان تستخدمهم كشف. على الرغم من أن البروتوكول يتضمن أسلوباً لإنتاج نوع المتوحش كشف من انصباب الابتدائي سرطان الغدد الليمفاوية الخلية خط BCBL-1، E6/E7-خلد الجماعة الأوروبية أيضا عرضه للعدوى مع باكميد المؤتلف المستمدة كشف BAC1630. يتم وصف بروتوكولات من أجل إعداد BAC16 في أماكن أخرى33،34.

<table><tbody><tr><td>خلايا BCBL-1</td><td>برنامج كاشف المعاهد الوطنية للصحة الإيدز</td><td>3233</td><td></td></tr><tr><td>خلايا PA317</td><td>ATCC</td><td>CRL-2203</td><td></td></tr><tr><td>الخلايا البطانية الجلدية الدقيقة لحديثي الولادة</td><td>Lonza</td><td>CC-2505</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 Basal Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>anti-KSHV LANA / ORF 73</td><td>Advanced التقنيات الحيوية</td><td>13-210-100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE TMExpress ، بدون فينول أحمر</td><td>ThermoFisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

نموذج في المختبر لدراسة التحول الخلوي من هربس كابوزي ساركوما

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

ساركوما كابوزي (KS) هو ورم غير عادية تتألف من تكاثر المغزل الخلايا التي يتم تهيئتها بواسطة عدوى خلايا بطانية (EC) مع كشف، ويطور في أغلب الأحيان في الإعداد للكبت المناعي. على الرغم من عقود من البحث، لا يزال العلاج الأمثل من كانساس غير المحددة بوضوح والنتائج السريرية غير مواتية وبخاصة في الأماكن المحدودة الموارد. الآفات KS تحركها تولد الأوعية المرضية، والتهاب مزمن، وأونكوجينيسيس، وقد وضعت في المختبر خلية ثقافة نماذج مختلفة لدراسة هذه العمليات. KS ينشأ من الخلايا المصابة بكشف أصل غشائي، حيث توفر خلايا الجماعة الأوروبية-النسب في المختبر أنسب البدائل للسلائف الخلية المغزل. ومع ذلك، نظراً لأن الجماعة الأوروبية لها عمر محدود في المختبر ، واليات النمطان تستخدمهم كشف أقل كفاءة من تلك الفيروسات الورمية الأخرى، لقد كان من الصعب تقييم عمليات التحول في التعليم الابتدائي أو خلد تيلوميراسي ec. ولذلك، وضع نموذج رواية ثقافة تستند إلى المفوضية الأوروبية بسهولة يدعم التحول بعد الإصابة مع كشف. التعبير حمل خارج الرحم من جينات فيروس الورم الحليمي البشري النوع 16 E6 و E7 يسمح للثقافة الموسعة لمطابقة العمر ومرور وهمية وكشف-المصابين بالمفوضية الأوروبية ويدعم تطوير حقاً تحولت (أي، ورمي) النمط الظاهري في الثقافات الخلية المصابة . وسهلت هذا النموذج أصعب واستنساخه بدرجة عالية من كانساس اكتشاف عدة مسارات إشارات أساسية ذات الإمكانات العالية للترجمة إلى إعدادات السريرية.

مورفولوجية EC الابتدائي الكلاسيكي توصف بأنها "حجر cobble"، ولا يتم تبديل هذا التشكل بالتعبير عن فيروس الورم الحليمي E6 و E7 الجينات (الشكل 1A). تعبير الجينات E6 و E7 وحدها لا الحث النمط الظاهري تحول؛ وهكذا، الخلايا عرضه للاتصال بتثبيط ويتوقف بتقسيم عند التوصل إلى التقاء في الثقافة. لكن سوف الخلايا تتكاثر وتنمو لالتقاء تريبسينيزيشن وريبلاتينج في أقل كثافة، مما يسمح للحفاظ على الثقافات العمر ومرور مطابقة لاستخدامها كعناصر تحكم إصابة صورية.
<p class="jove_content" fo:kee...

ساركوما كابوزي (KS) ورم الناجمة عن العدوى بالفيروس النمطان الإنسان هربس-8/KS هربس (هف-8/كشف). نموذج الثقافة غشائي خلية الموصوفة هنا مناسبة فريدة لدراسة الآليات التي تحول كشف الخلايا المضيفة.

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعداد وهمية متطابقة مع العمر والمرور في الخلايا البطانية المصابة ب KSHV لتمكين دراسة التغيرات المرتبطة ب KSHV في التعبير الجيني للخلية المضيفة بما في ذلك التغيرات التي تؤدي إلى التحول الخبيث في سياق الضوابط المناسبة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في تحديد التغيرات الفيزيولوجية المرضية الرئيسية في بيولوجيا الخلية المضيفة التي تؤدي إلى السرطانات المرتبطة ب KSHV ، وبالتالي تحديد أهداف علاجية جديدة للوقاية من الأمراض أو علاجها. الميزة الرئيسية لهذا النظام هي أن التحول الخبيث للخلايا البطانية بعد الإصابة ب KSHV يحدث بسرعة وبشكل متكرر مما يسمح بدراسة الأحداث المبكرة في عملية الأورام مع خلايا التحكم المتطابقة مع العمر والممر.على الرغم من أن هذا النموذج من تكوين الأورام الفيروسي يمكن أن يوفر نظرة ثاقبة لتطور ساركوما كابوسي ، إلا أنه يمكن تطبيقه أيضا على أنواع السرطان الأخرى. نظرا لأن ساركوما كابوسي هي ورم وعائي ، فإن الآثار المترتبة على نموذج زراعة الخلايا هذا تمتد نحو فهم عمليات المرض الأخرى التي يحركها تكوين الأوعية الدموية المرضية. للبدء ، قم بإعداد وتصفية مخزن TNE المعقم كما هو موضح في بروتوكول النص.ثم قم بتخزين المحلول عند أربع درجات مئوية. استزراع خط خلايا سرطان الغدد الليمفاوية الانصباب الأولي السلبي KSHV الإيجابي BCBL-1 في قارورة T150 مملوءة ب 60 مل من وسط RPMI. حافظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية 5٪ ثاني أكسيد الكربون للحصول على تعليق من 1 إلى 1.2 مرة تقريبا 10 إلى الخلايا السادسة لكل مليلتر.بمجرد الوصول إلى الكثافة المناسبة ، قم بتقسيم الخلايا من واحد إلى اثنين بوسط جديد وأضف PMA إلى التركيز النهائي البالغ 20 نانوغرام لكل مليلتر للحث على إنتاج KSHV. ثم احتضان الثقافات لمدة خمسة أيام. بعد خمسة أيام من الحضانة ، قم بحصاد الجزيئات الفيروسية عن طريق تدوير معلقات الخلية عند 300 مرة جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.ثم انقل المواد الطفية إلى أنبوب جديد. الطرد المركزي للطاقات الطافية مرة أخرى عند 2 ، 500 مرة جم عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق لإزالة الحطام الخلوي. الآن بعد أن تم توضيحه ، قم بتراكب خمسة ملليلتر من محلول السكروز بنسبة 25٪ في TNE مع ما يقرب من 30 مل من المادة الطافية في ستة أنابيب للطرد المركزي الفائق.الطرد المركزي الأنابيب المتوازنة عند 75 ، 000 مرة جم لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية تحت الفراغ. بمجرد اكتمال الطرد المركزي ، قم بصب المادة الطافية وصمة عار حافة كل أنبوب لإزالة أكبر قدر ممكن من السائل. ثم قم بتعليق الفيروس المحبب في 150 ميكرولتر من مخزن TNE المؤقت وقم بتجميع جميع العينات.امزج التعليق المجمع جيدا وقسمه إلى 25 ميكرولتر. قم بتخزين فيروس المخزون عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. زراعة الخلايا البطانية الجلدية أو الليمفاوية الأولية للبشرية في وسط EGM في قارورة T75.الحفاظ على زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى الوصول إلى التقاء 50٪ تقريبا. قبل نقل الخلايا البطانية ، استزراع خلايا PA317 LXSN 16E6E7 في قارورة ثقافة خلية T150 مملوءة ب 20 مل من DMEM عند 37 درجة مئوية 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بمجرد تحقيق التقاء 90٪ تقريبا ، استبدل الوسط من ثقافة الخلايا PA317 ب 16 مل من الوسط الطازج واحتضان الخلايا طوال الليل.بعد الحضانة الليلية ، اجمع الوسط من ثقافة الخلايا PA317 وقم بتوضيحه عن طريق الطرد المركزي عند 300 مرة جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. استبدل وسط EGM من 50٪ ثقافة الخلايا البطانية المتقاربة ب 12 مل من وسط PA317 المصفى. احتضان الخلايا لمدة أربع ساعات.ثم استبدل ستة ملليلتر من وسط PA317 بستة ملليلتر من وسط EGM الطازج واحتضان الخلايا طوال الليل. بعد ذلك ، قم بإزالة الوسط من ثقافة الخلايا البطانية وقم بتغذية الخلايا ب 12 مل من EGM الطازج. استمر في احتضان الخلايا لمدة 48 ساعة إضافية.لزراعة الخلايا البطانية الفرعية ، قم بإزالة الوسط وغسل الخلايا ب 12 مل من PBS الخالي من الكاتيون. ثم أضف ثلاثة ملليلتر من محلول التفكك الأنزيمي التجاري واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. انقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر وقم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 مرة جم لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.بمجرد تكوير الخلايا ، أعد تعليق الخلايا في وسط EGM جديد وقسم التعليق بالتساوي إلى ثلاث قوارير T75. اضبط حجم الثقافات على 12 مل من EGM لكل قارورة. ثم أضف 200 ميكروغرام لكل مليلتر من G418 لتحديد الخلايا البطانية المنقولة.حصاد الخلايا البطانية المنقولة عن طريق الهضم الأنزيمي كما هو موضح سابقا. أعد تعليق حبيبات الخلية البطانية في مليلتر واحد من وسط EGM. ثم امزج خمسة ميكرولترات من معلق الخلية مع 45 ميكرولترا من محلول التريبان الأزرق وعد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس كثافة الدم.البذور 2.5 في 10 إلى الخلايا الخامسة القابلة للحياة في ملليلترين من وسط EGM لكل بئر من صفيحة من ستة آبار. في اليوم التالي ، قم بإزالة وسط EGM واغسل الخلايا في كل بئر بثلاثة ملليلتر من PBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم. ثم أضف ملليلترين من وسط EBM إلى كل بئر.لإصابة الخلايا ب KSHV ، أضف خمسة إلى 20 ميكرولترا من مخزون الفيروس إلى كل بئر وقم بتدوير اللوحة لخلط المعلقات. أضف حجما متساويا من المخزن المؤقت TNE إلى كل بئر يحتوي على خلايا مصابة بهمية. بعد الطرد المركزي للوحة عند 400 مرة جم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، قم باحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.ثم أضف ملليلترين من وسط EGM إلى كل بئر واحتضان الثقافات بين عشية وضحاها. بعد الحضانة ، قم بإزالة وسط EGM من كل بئر واستبدله بملليلترين من EGM الطازج. عندما تصل الخلايا إلى ما يقرب من 90٪ من التقاء ، قم بحصادها عن طريق الهضم الأنزيمي كما هو موضح سابقا.قم بتجميع الخلايا من ثلاثة آبار في قارورة T75 مكتوب عليها بعدد الممرات الإجمالية في الممر بعد الإصابة. قبل الاختبار أو التجميد ، قم بتوسيع مزارع الخلايا البطانية الوهمية والمصابة ب KSHV عن طريق تقسيمها من واحد إلى ثلاثة لممرين إضافيين على الأقل. معروضة هنا صورة مجهرية للخلايا البطانية المصابة بالوهمية المتقاربة تكشف عن مظهر مرصوف بالحصى كلاسيكي.يتم تثبيط الانقسام الخلوي في هذه الخلايا عند ملامسته عندما تصل الثقافة إلى التقاء. تطور الخلايا البطانية المصابة ب KSHV مورفولوجيا ممدودة تشبه المغزل تذكرنا بخلايا مغزل Kaposi Sarcoma. على عكس الخلايا المصابة ب وهمية ، تستمر الخلايا البطانية المصابة ب KSHV في التكاثر حتى عندما تصل إلى التقاء مما يؤدي إلى تطوير بؤر خلوية متعددة الطبقات.عند فقدان الاتصال بالركيزة ، تخضع الخلايا البطانية المصابة بالصخور لموت الخلايا المبرمج ، anoikis ، بالإضافة إلى أنها لا تشكل مستعمرات في أجار ناعم. على العكس من ذلك ، فإن الخلايا المصابة ب KSHV تقاوم الأنويكيس والمستعمرات النامية عند زراعتها في أجار ناعم. يصاحب تطور مورفولوجيا المغزل على شكل مغزل في الخلايا البطانية المصابة ب KSHV التعبير عن بروتين الكمون الفيروسي ORF73 وبدرجة أقل عامل المعالجة الفيروسية ORF59.عند الإصابة ب KSHV BAC16 الموسومة ببروتين فلوري أخضر ، طورت الخلايا البطانية مورفولوجيا على شكل مغزل وتظهر تعبير GFP مما يؤكد العلاقة غير الرسمية بين عدوى KSHV في النمط الظاهري المرصود. بعد تطويره ، مهد نموذج زراعة الخلايا هذا الطريق للباحثين لتقييم التغيرات في mRNA للخلية المضيفة وتعبير البروتين الناجم عن عدوى KSHV. وبالتالي ، تم تحديد الآليات المسببة للأمراض الرئيسية الكامنة وراء تكوين الأورام بوساطة KSHV والتي تمثل أهدافا علاجية واعدة.لا تنس أن KSHV هو عامل BSL-2 ويجب التعامل معه من خلال إجراءات وممارسات احتواء السلامة البيولوجية المناسبة.

an-vitro-model-for-studying-cellular-transformation-kaposi-sarcoma

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يوضح هذا الأسلوب وسيلة فعالة لإعداد النسخ المتماثل أو المعيبة مخزونات فيروس ترميز الجين الورمي الإنسان ، واستخدمت لاحقا لتحريض مرض التكاثر النقيي في نموذج الفأر.

إنتاج النسخ المعيبة للفيروسات الارتدادية التي ترنسفكأيشن عابر للخلايا 293T

العوامل الخلية المضيفة تلعب دورا حاسما في إنشاء وصيانة ساركومة كابوزي (كانساس). نحن مخطط طرق لتحديد العوامل الخلية المضيفة تغيير في الخلايا المصابة KSHV DMVEC ، وفي نسيج الورم KS وسوف تغير من الجينات الخلوية الفيروس بمثابة هدف محتمل ل المداواة الرواية.

تحديد الجينات المستحثة بواسطة Dysregulated الفيروسة ساركومة المرتبطة كابوزي (KSHV)

وصفنا بروتوكول لتحديد الأدوار الرئيسية للجزيئات إشارة المضيف في النسخ المتماثل للهربس التحللي نموذج، غاما هربس 68 (γHV68). استخدام سلالات الفئران المعدلة وراثيا والخلايا الليفية الجنينية لتكرار التحللي γHV68، وبروتوكول يسمح كل من توصيف المظهري والجزيئي للفيروس الاستجواب في استضافة التفاعلات في النسخ المتماثل التحللي الفيروسية.

تشريح المضيف للفيروسات التفاعل في النسخ المتماثل التحللي من الفيروسة الموديل

يوصف أسلوب للمراقبة الفردية جزيئات الحمض النووي في الخلايا الحية. ويستند هذا الأسلوب على الربط من البروتين الموسومة fluorescently قامع أمريكا اللاتينية والكاريبي لتصميم مواقع الربط DNA في المصالح. ويمكن تكييف هذه الطريقة لمتابعة السلطات الوطنية المعينة المؤتلف كثيرة في الخلايا الحية على مر الزمن.

رصد النسخ المتماثل البلازميد في خلايا الثدييات يعيش أكثر من أجيال متعددة من مضان المجهري

وصفنا بروتوكول لقياس إنتاج السيتوكينات المضادة للفيروسات في الفئران المصابة مع هربس النموذج، الفئران غاما هربس 68 (γ HV68) التي هي ذات الصلة ارتباطا وثيقا المرتبطة ساركوما هربس الإنسان كابوزي (KSHV) وفيروس ابشتاين بار (EBV). استخدام سلالات الفئران المعدلة وراثيا والخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs)، قمنا بتقييم إنتاج السيتوكينات المضادة للفيروسات سواء في الجسم الحي وخارج الحي. "اعادة تشكيل" التعبير عن مكونات المناعة الفطرية في الخلايا الليفية الجنينية خروج المغلوب من قبل تنبيغ lentiviral،...

تشريح الفطري اشارة المناعة في التهرب الفيروسية من الإنتاج خلوى

أنشأنا فلوري التهجين الموضع البروتوكول في للكشف عن فيروس الحمض النووي الجينوم المستمرة داخل أقسام الأنسجة من النماذج الحيوانية. هذا البروتوكول يتيح دراسة عملية العدوى عن طريق codetection من الجينوم الفيروسي، والمنتجات RNA لها، والبروتينات الفيروسية أو الخلوية داخل الخلايا واحد.

الكشف عن الجينوم والنصوص من الفيروسات الحمض النووي في الخلايا العصبية الأنسجة الثابتة التي كتبها نيون في الوضع الطبيعي التهجين جنبا إلى جنب مع المناعية

يمكن استخدام الخلايا النجمية من النوع البري الظاهري والخلايا الجذعية العصبية التي تم حصادها من الفئران المصممة باستخدام أليلات مسرطنة مشروطة ومحولة عن طريق إعادة التركيب الفيروسي بوساطة Cre لنمذجة التسبب في الورم النجمي في المختبر وفي الجسم الحي عن طريق الحقن التقويمي للخلايا المحولة في أدمغة زملاء القمامة المتخصصين في المناعة.

النمذجة الخلايا النجمية إمراض في المختبر و في فيفو استخدام القشرية النجمية أو الخلايا الجذعية العصبية من الشرطي، الفئران المهندسة وراثيا

نحن نصف بروتوكول باستخدام الفلورة في الموقع التهجين (FISH) لتصور RNAs الهربس الفيروسي متعددة داخل الخلايا البشرية المصابة lytically، إما في تعليق أو التمسك. يتضمن هذا البروتوكول تحديد كمية الفلورة التي تنتج نسبة النيوكليوسيتوبلازمية ويمكن تمديدها للتصور المتزامن للبروتينات المضيفة والفيروسية ذات الفلورة المناعية (IF).

الفلورة الكمية في الموقع التهجين (FISH) والفلورة المناعية (IF) من منتجات جينية محددة في الخلايا المصابة KSHV

يصف هذا البروتوكول إنشاء نموذج ماوس يحمل الورم لمراقبة تطور الورم وتكوين الأوعية الدموية في الوقت الحقيقي عن طريق التصوير الغمر الحيوي المزدوج.

التصوير الإنارة الحيوية المزدوجة لتقدم الورم وتكوين الأوعية الدموية

يوفر هذا البروتوكول أدوات تجريبية في المختبر لتقييم تحول الخلايا الثديية البشرية. ويرد وصف الخطوات التفصيلية لمتابعة معدل انتشار الخلايا، والقدرة على النمو المستقلة للرسو، وتوزيع أنساب الخلايا في الثقافات ثلاثية الأبعاد مع مصفوفة غشاء الطابق السفلي.

في المختبر تقييم التحول Oncogenic في الخلايا الظهارية ماماري الإنسان

يصف هذا البروتوكول نظاما في المختبر لنمذجة العدوى اللايتية من جديد لفيروس الهربس المرتبط بساركوما كابوسي باستخدام الفيروسات المشتقة من BAC16. تتيح هذه الطريقة التحقيق في التكاثر الفيروسي المبكر وانتشاره. يتم قياس إنتاج الفيروسات المعدية من خلال فحوصات الوحدات المعدية القائمة على GFP و PCR في الوقت الفعلي للجينومات الفيروسية المغلفة.

إنشاء وقياس العدوى اللايتية بدي نوفو بواسطة فيروس الهربس المرتبط بساركوما كابوسي الخالي من الخلايا

استكشف نموذج الخلايا البطانية المصابة بفيروس KSHV لدراسة التحول الخبيث في ساركوما كابوزي. يتيح هذا النظام تحليل التغيرات الجينية المبكرة وتحديد أهداف علاجية جديدة.

نموذج في المختبر لدراسة التحول الخلوي من هربس كابوزي ساركوما

استكشف المزيد من الفيديوهات