توسيع Nanopatterned ركائز باستخدام تقنية غرزة لNanotopographical التحوير سلوك الخلية

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنتاج مساحة كبيرة من الركيزة ذات الأنماط النانوية من قوالب نانوية صغيرة باستخدام تقنية خياطة بسيطة وميسورة التكلفة ومتعددة الاستخدامات. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في دراسة تعديل التضاريس النانوية للركيزة على النمط الظاهري للخلية ووظيفتها على المستويين الخلوي والجزيئي، مثل التعبير عن بروتينات الالتصاق البؤري. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي بساطتها وفعاليتها من حيث التكلفة.

للبدء، قم بتجهيز قالب السيليكون المعالج بالسيليلزة في بوليمر PDMS المسبق، كما هو موضح في البروتوكول النصي. ضع قالب السيليكون المعالج بالسيليلزة في طبق بتري بقطر 60 مليمتر. صب بوليمر PDMS المسبق فوق قالب السيليكون في طبق بتري.

ضع طبق بتري في مجفف بلاستيكي وقم بإزالة الغازات لمدة 10 دقائق تقريبًا، حتى تختفي جميع الفقاعات. انقل طبق بتري إلى لوح تسخين وقم بمعالجة بوليمر PDMS المسبق عند 70 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. قم بإزالة قالب PDMS بعناية من قالب السيليكون باستخدام ملاقط.

حدد اتجاه الأنماط النانوية لـ PDMS متباينة الخواص، مثل الشبكات النانوية، باستخدام مجهر ضوئي، وقم بتحديد هذا الاتجاه على الجانب الخلفي من قوالب PDMS باستخدام قلم تحديد. نظف الركيزة السيليكونية باستخدام الإيثانول داخل خزانة الغازات، ثم جففها باستخدام الهواء المضغوط. قم بقص المناطق غير المنقوشة من كل قالب PDMS باستخدام شفرة.

يجب محاذاة قوالب PDMS بحيث تكون قريبة قدر الإمكان من بعضها البعض، دون أن تلامس القالب المحيط، وذلك لتقليل المنطقة غير المنقوشة ولتجنب ملامسة تشوه النقش النانوي عند تطبيق قوة الضاغط. ضع قالب PDMS المقصوص بحيث يكون وجه النقش النانوي لأسفل على الجانب المرآتي من ركيزة السيليكون، ثم قم بمحاذاة القوالب الأخرى لتكون قريبة من القوالب المحيطة ولكن دون ملامستها. ومن الضروري محاولة معالجة PDMS عند الطبقة القاعدية لأن PDMS غير المعالج قد يتدفق عبر الفجوة الموجودة بين القوالب المتعددة ويتسبب في تلف النقوش النانوية.

ومع ذلك، لا يمكن لـ PDMS المعالج تماماً أن يربط القوالب المتعددة معاً. ولتحضير طبقة لاصقة من PDMS، يتم صب جرام واحد من بوليمر PDMS التمهيدي المفرغ من الغازات على شريحة زجاجية نظيفة لتكوين طبقة بسمك 0.5 mm. تُخبز طبقة PDMS عند 100 °C على لوح تسخين لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق.

استخدم إبرة للمس الطبقة والتأكد من أنها معالجة جزئيًا وليس بشكل كامل. ضع طبقة PDMS على الجانب الخلفي من قوالب PDMS المحاذات، ثم اقلب هذه المجموعة بسرعة وانقلها إلى الصفيحة الساخنة. طبق قوة ضغط باستخدام كتلة معدنية فوق المجموعة لضمان التلامس الجيد بين طبقة PDMS اللاصقة والجانب الخلفي من قوالب PDMS.

قم بمعالجة طبقة لاصق PDMS عند 100 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. أوقف تشغيل اللوح الساخن، وأزل الكتلة المعدنية، ثم قم بتقشير قالب PDMS ذو الغرزة الواحدة من ركيزة السيليكون. لطباعة قالب PDMS المنسوج بنظام النانو على لوح PS، ضع لوح PS في فاصل من الألومنيوم مثبت على رقاقة سيليكون بحجم ثلاثة بوصات.

سخن صفيحة PS على جهاز تسخين عند 250 degrees Celsius لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، ضع قالب PDMS المخيط، بحيث تكون الأنماط النانوية متجهة للأسفل، فوق صفيحة PS المنصهرة. ثم، ضع صفيحة ألومنيوم على الشريحة الزجاجية لقالب PDMS المخيط.

قم بتطبيق ضغط ضاغط باستخدام كتل معدنية على الصفيحة الألومنيومية، وانتظر لمدة ثلاث دقائق. ارفع الكتلة المعدنية واستبدلها على الصفيحة الألومنيومية، وزد الضغط الضاغط إلى 25 kilopascals. بعد ذلك، كرر هذه الخطوة مع زيادة الضغط إلى 50 kilopascals.

حافظ على درجة حرارة اللوحة الساخنة بين 240 و 250 درجة Celsius تحت ضغط ثابت قدره 50 kilopascals لمدة 15 دقيقة. أوقف تشغيل اللوحة الساخنة، واترك الجهاز بالكامل ليبرد. قم بإزالة الكتل المعدنية بعد أن تنخفض درجة الحرارة إلى ما دون 50 درجة Celsius، ثم انزع بعناية قالب PDMS المخيط من لوحة PS.

لطباعة قالب PDMS بالبصمة النانوية على فيلم رقيق من PS، ضع قالب PDMS المجمّع بحيث يكون وجه التضاريس النانوية لأسفل على فيلم PS الرقيق الموضوع على لوح تسخين. طبّق ضغطاً انضغاطياً قدره 12 kilopascals على قالب PDMS باستخدام كتل معدنية على الشريحة الزجاجية لقالب PDMS. ارفع درجة حرارة لوح التسخين إلى 180 degrees Celsius، وحافظ عليها لمدة 15 minutes.

أطفئ السخان اللوحي، واترك المجموعة كاملة لتبرد. قم بإزالة الكتل المعدنية بعد انخفاض درجة الحرارة إلى أقل من 50 °C، ثم انزع بعناية قالب PDMS المخيط من غشاء PS. وباستخدام ثاقبة قوس فولاذية مجوفة، قص ركائز PDMS ذات الأنماط النانوية إلى أقراص تتناسب مع تكوين لوح متعدد الآبار محدد.

بعد ذلك، استخدم الملاقط لوضع أقراص PDMS في آبار الصفيحة متعددة الآبار. قم بتعقيم ركائز PDMS باستخدام 70%ethanol لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، قم بشفط ethanol، ثم اتبع ذلك بالتعريض للأشعة فوق البنفسجية UV لمدة 30 دقيقة.

اغسل ركائز PDMS بمحلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) معقم بتركيز 1X ثلاث مرات. بعد ذلك، غطِّ ركائز PDMS ببروتين المصفوفة خارج الخلوية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اشطف ركائز PDMS ثلاث مرات باستخدام PBS معقم، لمدة خمس دقائق في كل مرة.

قم بتعليق خلايا سرطان الرئة البشرية A549 في وسط Dulbecco's Modified Eagle Medium مع 10% fetal bovine serum، وقم بعدّ الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer). ازرع الخلايا بكثافة استزراع تبلغ 2,000 cells per square centimeter على ركائز PDMS. قم باستزراع الخلايا عند درجة حرارة 37 °C في جو رطب يحتوي على 5% carbon dioxide لمدة يوم واحد، ثم قم بملاحظتها بعد ذلك.

يظهر هنا النمط النانوي المتولد على لوح PS والفيلم الرقيق. تشير الأسهم إلى بروز البوليمر في الفراغات البينية لقوالب PDMS المجمعة. وتوضح صور SEM هذه أن الركائز العاملة من PDMS قد نُقلت بدقة من النمط النانوي المكتوب باستخدام الليثوغرافيا بالحزمة الإلكترونية عن طريق تطبيق تقنية التجميع.

تظهر هنا صور مجهر إلكتروني ماسح (SEM) تمثيلية لخلايا A549 التي نمت على شبكات نانوية وأعمدة نانوية. تُظهر الخلايا مورفولوجيا خلوية مصطفة على الشبكات النانوية، بينما تنتشر الخلايا بشكل عشوائي على الأعمدة النانوية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء منطقة واسعة من الركائز ذات الأنماط النانوية عن طريق تجميع عدة قوالب نانوية نمطية صغيرة ومحددة.

لا تنسَ أن التعامل مع التولوين والبارافورمالدهيد يمكن أن يكون خطيرًا للغاية، لذا يجب دائمًا ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة أثناء تنفيذ الإجراءات.