تطوير نظام الفيروسات مراسل التهاب الكبد B لرصد المراحل المبكرة من دورة النسخ المتماثل

الهدف العام لنظام الإبلاغ عن فيروس التهاب الكبد B المؤتلف هذا هو تسهيل إجراء الفحص الجماعي لفيروس التهاب الكبد B المضاد ، أو عوامل التهاب الكبد B. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال التهاب الكبد B ، مثل فحص العوامل المضادة لفيروس التهاب الكبد B وتحديد عوامل التهاب الكبد Bv. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن نظام مراسل HBV يمكنه مراقبة المراحل السابقة من دورة تكرار HBV.

بعد تحضير وسط زراعة الخلايا ، في اليوم السابق للحمل ، ضع أربع مرات 10 إلى خلايا HepG2 الست في وسط ، على طبق مغطى بالكولاجين مقاس 10 سم. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب بنسبة 5٪ CO2. باستخدام عامل transvectionary وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، قم بنقل الخلايا ب 5 ميكروغرام من pUC1 2HBV delta epsilon و 5 mcg من pUC1 2HBV / NL.

في اليوم التالي ، قم بإزالة وسط المزرعة وأضف 10 مل من وسط الاستزراع الطازج. ثم ، بعد أسبوع واحد من النقل ، انقل وسط الثقافة الذي يحتوي على فيروس التهاب الكبد B المؤتلف إلى أنبوب 50 مل. بعد ذلك ، أضف 10 مل من وسط الزراعة الطازجة إلى اللوحة التي تحتوي على خلايا منقولة.

ثم اجمع وسيط الاستزراع وقم بالطرد المركزي عند 2 ، 300 × جم لمدة خمس دقائق لإزالة بقايا الخلية التي تحتوي على فيروس التهاب الكبد B المؤتلف. مرر المادة الطافية من خلال مرشح غشائي 45 ملي سم. ثم أضف حجما متساويا من 25٪ PEG ، 1.5 مولار كلوريد الصوديوم ، إلى المرشح ، واخلطه برفق.

احتضان العينة طوال الليل عند أربع درجات مئوية ، وفي اليوم التالي ، قم بتدوير المحلول عند 2 ، 300 × جم وأربع درجات مئوية ، لمدة 20 دقيقة. تخلص من المادة الطافية وقم بإذابة الحبيبات في 5 مل من المخزن المؤقت TNE. الآن قم بالطرد المركزي للعينة مرة أخرى لإزالة بقايا الخلية ، ثم قم بتحميل 5 مل من HBV المؤتلف المحتوي على TNE على 8 مل من 20٪ سكروز في TNE.

جهاز الطرد المركزي الاثنين عند 100 ، 000 × جم و 15 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات. تخلص من أكبر قدر ممكن من المادة الطافية واستخدم 1 مل من DMEM الخالي من المصل لكل 40 مل من بدء المزرعة لإعادة تعليق الحبيبات. احتضان المعلق عند أربع درجات مئوية طوال الليل.

في صباح اليوم التالي ، قم بتصفية التعليق من خلال مرشح 45 ملي سم. ثم قم بإعداد 5 مل من الحصص وتخزين الأنابيب عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. خلايا HepG2 الصفيحة ، التي تعبر بثبات عن بولي ببتيد النقل المشترك للصوديوم ، أو NTCP ، المعرضة للإصابة بعدوى فيروس التهاب الكبد B ، وتحتضن عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.

قبل يوم واحد من الإصابة ، ضع حوالي خمسة أضعاف 10 إلى خلايا HepG2 NTCP الرابعة في آبار صفيحة مطلية بالكولاجين 96 بئرا ، في 1 مل من وسط الاستزراع. قم بإذابة فيروس التهاب الكبد B المؤتلف في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية ، حتى يتبقى القليل من الثلج في القارورة. تحضير وسط للعدوى عن طريق الجمع بين 78 مللي لتر من وسط الاستزراع الطازج ، و 2 مللي لتر من DMSO ، و 10 مللي لتر من 40٪ PEG 8000 ، في 1x PBS ، و 10 مللي لتر من فيروس الورم الحليمي البشري المؤتلف.

أضف 100 مل لتر من محلول HBV المؤتلف إلى كل بئر من لوح 96 بئرا. بعد يوم واحد من الإصابة ، استخدم 300 مللي لتر من PBS لغسل الخلية ثلاث مرات لإزالة بروتين المراسل الملوث من جزء الفيروس. أضف 200 مللي لتر من وسط المزرعة ، الذي يحتوي على 2٪ DMSO ، إلى الخلايا المصابة ، واحتضنه لمدة أسبوع أو أقل.

لإجراء تحليل لعدوى فيروس التهاب الكبد B ، بعد أسبوع واحد من الإصابة ، استخدم PBS لغسل الخلايا المصابة ثلاث مرات. أضف 50 مللي لتر من Lysis Buffer إلى الخلايا المصابة. هز لوحة الثقافة لمدة خمس دقائق ثم جهاز الطرد المركزي عند 2,000 × جم لمدة خمس دقائق.

أضف 50 مللي لتر من ركيزة المراسل إلى لوحة مقياس الإلواء. ثم أضف 20 مللي لتر من محللة الخلية إلى الطبق واخلطها عن طريق رجها لفترة وجيزة. أخيرا ، ضع اللوحة في مقياس الإضاءة وابدأ القراءة.

يظهر هذا الجل هضم البلازميد المراسل pUC1 2HBVNL المبني ، وبلازميد دلتا المساعد pUC1 2HBV مع HindII و EcoRI. تنتج كلتا العينتين أحجام النطاق المتوقعة. في هذه اللطخة الغربية ، تم فحص المحللات من خلايا HepG2 ، أو خلايا HepG2 التي تعبر عن NTCP المؤتلف الموسومة ب myc والمصابة بفيروس التهاب الكبد B المؤتلف ، بجسم مضاد مضاد ل myc يتعرف على 34 كيلو دالتون غير الجليكوزيل والبروتينات المؤتلفة 65 كيلو دالتون.

توضح الرسوم البيانية الموضحة هنا حركية جين المراسل. مستويات الحمض النووي الريبي والحمض النووي في فيروس التهاب الكبد B المؤتلف المصابة ب HepG2 NTCP myc-clone 22 ، أو خلايا الكبد الأولية البشرية. ارتفعت مستويات الحمض النووي الريبي HBV في نشاط المراسل بعد ثلاثة أيام من الإصابة ، في كل من الخلايا المصابة وخلايا الكبد الأولية.

في المقابل ، لم يكن هناك تغيير في مستويات الحمض النووي بعد تسعة أيام من الإصابة ، لأن فيروس التهاب الكبد B المؤتلف يعاني من نقص في اللب والقطب الوظيفي ، اللذين يلعبان أدوارا مهمة في مسار تكرار الحمض النووي داخل الخلايا. في هذا الشكل ، يتم توضيح تثبيط فيروس التهاب الكبد B المؤتلف بواسطة الجلوبيولين المناعي لالتهاب الكبد B ، أو HBIG و Heparin و IFN-beta. قمع HBIG و Heparin بشدة نشاط المراسل إلى أقل من 10٪ عند 75 وحدة / مل ، و 150 وحدة / مل ، على التوالي.

ناحية أخرى ، قمع IFN-beta نشاط المراسل إلى أقل من 50٪ عند 1000 وحدة / مل. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في أسبوع واحد لتحضير فيروس التهاب الكبد B المؤتلف ، في ستة أيام للعدوى فيروس التهاب الكبد B المؤتلف ، وباختصار ، وسائل قياس بروتين المراسل ، إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر خطوة الغسيل التي تزيل بروتين المراسل الملوث من جزء التحيز.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء نتائج أخرى مثل العدوى بفيروس التهاب الكبد B الواسع من أجل الإجابة على سؤال إضافي مفاده أن فيروس التهاب الكبد B المؤتلف لم ينتج عنه نتائج إيجابية أولى. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال فيروس التهاب الكبد B لاستكشاف تطوير عامل مضاد لفيروس التهاب الكبد B في نموذج زراعة الخلايا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنقية الخلايا وإصابة الخلايا بفيروس التهاب الكبد B المؤتلف.

لا تنس أن العمل مع فيروس التهاب الكبد B المؤتلف يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.