3D الكمي في السيليكو النمذجة (q3DISM) من الدماغيه اميلويد بيتا البلعمة في نماذج القوارض من مرض الزهايمر

الهدف العام من هذه الكمية ثلاثية الأبعاد في نمذجة السيليكو ، أو تقنية q3DISM ، هو تحديد امتصاص الأميلويد بيتا بواسطة الخلايا البلعمية أحادية النواة في أدمغة نماذج القوارض لمرض الزهايمر. تلبي هذه الطريقة حاجة ملحة في مجال أبحاث مرض الزهايمر لتحديد إزالة الأميلويد بيتا الذي يترسب في أدمغة مرضى الزهايمر الذين يشكلون لويحات الشيخوخة. لأول مرة ، تتيح هذه التقنية إعادة بناء 3-D حقيقية وتحديد كمية الأميلويد بيتا بواسطة البلاعم في الجسم الحي بدأنا في استخدام 3-Dism لدراسة ترسب الأميلويد بيتا لأننا كنا بحاجة إلى أداة قوية لتصور وقياس البلعمة الدقيقة في الجسم الحي.

قد تكون هذه التقنية مفيدة في اختبار العلاجات التجريبية لمرض الزهايمر لتقييم الأدوية التي تحفز البلاعم من أجل الإزالة الفعالة للأميلويد بيتا. عندما تكون عينات الأنسجة جاهزة للتلوين المناعي ، املأ منطقة الأنسجة المحاطة بالقلم الكارهة للماء بمخزن مانع لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة. في نهاية الحضانة ، استبدل المخزن المؤقت المانع بأول جسم مضاد أولي محل اهتمام بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية في الغرفة المرطبة.

في صباح اليوم التالي ، اغسل العينات في ثلاثة حمامات PBS لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة مع تحريك خفيف. بعد الغسيل الثالث ، احتضن الشرائح بالجسم المضاد الثانوي الفلوري المناسب في درجة حرارة الغرفة المحمية من الضوء. بعد ساعة واحدة ، اغسل الأقسام ثلاث مرات أخرى في PBS محمي من الضوء.

ثم قم بتسمية الخلايا بالأجسام المضادة الأولية والثانوية الأخرى المناسبة للأنسجة ذات الأهمية خلال اليومين إلى الأربعة أيام القادمة كما هو موضح للتو. لتلطيخ المقصورات الخلوية وفائقة الخلايا ورواسب الأميلويد بيتا بكفاءة ، من الضروري وضع العلامات بجسم مضاد أساسي واحد فقط في كل مرة متبوعا بالجسم المضاد الثانوي المقابل. عملية تستغرق وقتا طويلا ولكنها تعمل على تحسين النتائج.

بعد الغسيل الأخير من تلطيخ الجسم المضاد الثانوي ، اترك الأقسام تجف تماما طوال الليل في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد ذلك ، قم بتغطية العينات المجففة بقلة غطاء محكمة الغلق بواسطة وسيط تركيب الفلورسنت الذي يحتوي على DAPI. لتصوير العينات عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر ، حدد هدف المجهر 60x وأضف زيت الغمر إلى العدسة.

ضع العينة على حامل شريحة مرحلة المجهر وارفع الهدف حتى يتلامس الزيت مع الشريحة. باستخدام إضاءة epifluorescent ، اضبط المستوى البؤري لتحديد لويحات الأميلويد في الحصين أو القشرة الدماغية. بعد ذلك ، احصل على صور متحدة البؤر للخلايا البلعمية أحادية النواة المنشطة المحيطة برواسب الأميلويد في الحصين أو القشرة.

بالنسبة للنمذجة ثلاثية الأبعاد النوعية في السيليكو ، قم أولا بتحليل مجموعات البيانات متحدة البؤر باستخدام معالجة الصور العلمية ثلاثية الأبعاد في وحدة تحديد موقع برنامج التحليل للقرب المكاني من تلطيخ علامة البلاعم المنشطة في جميع مستويات Z في وقت واحد. قم بإنشاء قنوات تحديد الموقع التي تتوافق مع تلطيخ البلعمة داخل الخلايا البلعمية أحادية النواة المنشطة. حدد TRITC للقناة A ، و FITC للقناة B.In نافذة التحقق من الوضع ، حدد Threshold.

بالنسبة لشدة التوطين المشترك، حدد القنوات المصدر. انقر فوق تحرير لتحديد لون الترجمة المشتركة. ثم اضبط عتبات كل قناة بشكل مستقل لتضمين التلوين المحدد واستبعاد الخلفية والإشارات غير المحددة.

ستظهر voxels colocalized بلون colocalization المحدد في جميع z-stacks في وقت واحد. بعد ذلك ، انقر فوق إنشاء قناة Colocalization. ستظهر قناة colocalizaton التي تم إنشاؤها في نافذة ضبط العرض.

انقر فوق قناة colocalization لفتح إحصائيات القناة. تمثل النسبة المئوية لمادة الحجم A فوق العتبة المتوضعة حجم الخلية الأحادية التي تشغلها الجسيمات البلعمية. باستخدام وحدة التموضع المشترك ، قم بتحليل قناة التموضع المشترك للقرب المكاني مع إشارات الأميلويد بيتا لتحديد كمية الأميلويد بيتا المغلفة داخل الجسيمات البلعمية.

حدد مجموعة بيانات الترجمة المشتركة للقناة A و Cy5 للقناة B وقم بإنشاء قناة colocalization كما هو موضح للتو. انقر فوق قناة الترجمة المشتركة لفتح إحصائيات القناة مرة أخرى. تمثل النسبة المئوية لمادة الحجم A فوق العتبة المتوضعية الحجم البلعمي الذي يشغله الأميلويد بيتا.

باستخدام وحدة تجاوز ، أعد بناء مكدسات الصور متحد البؤر وقم بإنشاء نماذج ثلاثية الأبعاد للأميلويد بيتا المغلف داخل الجسيمات البلعمية أحادية الخلية. في نافذة ضبط العرض ، حدد TRITC لإظهار تلطيخ البلاعم فقط ، وانقر فوق إضافة سطح جديد "في خصائص وحدة الصوت. ضمن الإعدادات، في الخطوة الأولى من الخوارزمية، حدد Surface.

بالألوان، حدد نوع اللون محل الاهتمام واضبط الشفافية حسب الاقتضاء. ثم حدد مربع تحديد منطقة الاهتمام وانقر فوق التالي. في الخطوة الثانية من خمسة، منطقة الاهتمام، اضبط إحداثيات X وY وZ لرسم نافذة حول خلية الاهتمام وانقر فوق التالي.

في الخطوة الثالثة من الخامسة ، القناة المصدر ، حدد قناة مصدر TRITC وحدد مربع السلس. اضبط مستوى تفاصيل مساحة السطح على 0.4 ميكرون وانقر فوق التالي. في الخطوة الرابعة من خمسة ، العتبة ، اضبط العتبة بحيث يتداخل الحجم الذي تم إنشاؤه تماما مع إشارة قناة TRITC وانقر فوق التالي.

أخيرا، في الخطوة الخامسة من خمسة، قم بتصنيف الأسطح، في قسم أنواع عوامل التصفية، حدد الكائنات بناء على حجمها المراد تضمينها أو استبعادها من وحدات التخزين المراد إنشاؤها. كرر نفس الخطوات لإنشاء أسطح ثلاثية الأبعاد للبلعمة مع قناة FITC والأميلويد بيتا مع قناة Cy5. بعد النمذجة ثلاثية الأبعاد النوعية في السيليكو ، كما هو موضح للتو ، يمكن تحليل امتصاص الأميلويد بيتا في الجسيمات البلعمية أحادية الخلية في أدمغة الفئران والجرذان المعدلة وراثيا.

ومن المثير للاهتمام ، أن الحجم الذي تشغله الجسيمات البلعمية الإيجابية CD68 يزداد بشكل كبير في الخلايا البلعمية أحادية النواة الإيجابية Iba1 ، المرتبطة ، مقارنة باللويحات البعيدة ، في كل من الفئران والجرذان ، مما يدل على أن الخلايا البلعمية أحادية النواة بالقرب من اللويحات مهيأة للبلعمة ، مقارنة بالخلايا الموجودة بعيدا عن اللويحات. من الجدير بالذكر أيضا أن الخلايا البلعمية أحادية النواة المرتبطة بالبلاك تظهر امتصاصا متزايدا للأميلويد بيتا في الفئران المعدلة وراثيا مقارنة بالخلايا البعيدة عن اللويحات بينما في الفئران المعدلة وراثيا لوحظ امتصاص متواضع جدا لألياف الأميلويد بيتا بشكل عام ، مع عدم وجود تغيير واضح في البلعمة الليفية الأميلويد بيتا كدالة للمسافة من اللويحات. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن جودة الصور متحد البؤر أمر بالغ الأهمية وأنه يجب تطبيق عتبات مماثلة لجميع القنوات أثناء تحليل التوطين المشترك.

منذ تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الالتهاب العصبي لاستكشاف الأحداث البلعمية في أدمغة نماذج القوارض لمرض الزهايمر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تسمية أقسام دماغ القوارض للخلايا البلعمية أحادية النواة ، والبلعمة ، والأميلويد بيتا. لتحديد البلعمة الدماغية الأميلويد بيتا في 3-D في الجسم الحي.