محرض الموسومة LAP خطوط الخلية مستقرة للتحقيق في وظيفة البروتين، الزمانية المكانية التعريب وشبكات التفاعل البروتين

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد توطين محفز وتنقية التقارب ، أو خطوط الخلايا المستقرة الموسومة ب LAP ، للتحقيق في وظيفة البروتين ، والتوطين الزماني المكاني ، وشبكات تفاعل البروتين. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في البيولوجيا الجزيئية والخلوية المتعلقة بوظيفة البروتين ، وتوطين دورة خلية البروتين تحت الصفر ، وتفاعلات البروتين. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها قابلة لتحليل الإنتاجية العالية لمجموعات البروتينات ، ويمكن استخدامها لتشريح مكونات البروتين في المسارات البيولوجية.

لبدء هذا الإجراء ، قم باستنساخ إطار القراءة المفتوح للجين محل الاهتمام في المتجه الذي يضع علامة LAP وقم بتحويله إلى خلايا HEK293 كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد يوم واحد من التعداد، استبدل وسائط Tet DMEM/F12 الناقص بوسائط جديدة. بعد يومين من التعدي ، قم بتقسيم الخلايا إلى التقاء 25٪.

اترك الخلايا حوالي خمس ساعات للاتصال. بعد ذلك ، أضف وسائط Tet DMEM / F12 المحتوية على الهيغروميسين بتركيز محدد مسبقا. بالنسبة لخلايا HEK293 ، استخدم 100 ميكروغرام لكل مليلتر هيغروميسين.

استبدل الوسائط حسب الحاجة حتى تظهر بؤر خلوية مميزة تشبه البقع غير الشفافة على اللوحة الشفافة. أضف 20 ميكرولترا من التربسين فوق كل بؤرة خلية وقم بتثبيتها لأعلى ولأسفل مرتين باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر. انقل الخلايا في صفيحة مكونة من 24 بئرا وقم بتوسيع الخلايا عن طريق النمو المستمر في وسائط Tet DMEM / F12 المحتوية على الهيغروميسين مطروحا منها Tet DMEM / F12.

قم بتوسيع خط الخلايا الذي تم التحقق من صحته من خلال LAP لتنقية التقارب الترادفي ، أو TAP ، عزل مجمعات البروتين. للقيام بذلك ، قم باستمرار بتمرير جميع خلايا HEK293 إلى ألواح أكبر و / أو زجاجات أسطوانية ، وناقص وسائط Tet DMEM / F12 عند 37 درجة مئوية وخمسة بالمائة من ثاني أكسيد الكربون. بالنسبة لخطوط الخلايا المحفزة Tet / Dox ، قم بتحفيز الخلايا لمدة 10 إلى 15 ساعة عن طريق إضافة تركيز 0.2 ميكروغرام لكل مليلتر Tet / Dox عندما تصل الخلايا إلى حوالي 70٪ من التقاء.

حصاد الخلايا عن طريق التحريض أو التربسين. ثم ، قم بتكبيبها في 875 مرة جم لمدة خمس إلى 10 دقائق. لإقران الجسم المضاد ل GFP بخرز البروتين A ، قم بموازنة 160 ميكرولترا من حبات البروتين A ذات الحجم المعبأ مع PBST في أنبوب 1.5 ملليلتر.

اغسل الخرزات ثلاث مرات ب 1 ملليلتر من PBST. بعد كل خطوة غسيل خلال هذا الإجراء ، يتم طرد الخرزات بمعدل 5000 مرة جم لمدة 10 ثوان ، ويتم إزالة المادة الطافية. بعد إعادة تعليق الخرزات في 500 ميكرولتر من PBST ، أضف 80 ميكروغراما من الجسم المضاد السريع المضاد ل GFP المنقى إلى كل أنبوب ، يحتوي على 160 ميكرولتر من الخرز.

تخلط لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الخرزات مرتين بمليلتر واحد من PBST ، ثم اغسل الخرزات مرتين بمليلتر واحد من بورات الصوديوم 0.2 مولار ، درجة الحموضة بعد الغسيل النهائي ، أضف 900 ميكرولتر من مخزن بورات الصوديوم ، ليصل الحجم النهائي إلى مليلتر واحد. ثم أضف 100 ميكرولتر من 220 مولار DMP إلى معلق الخرزة ، للحصول على تركيز نهائي يبلغ 20 ملليمول.

قم بتدوير الأنابيب برفق في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة باستخدام DMP ، اغسل الخرزات مرة واحدة بمليلتر واحد من 0.2 مولار إيثانول أمين ، 0.2 مولار كلوريد الصوديوم الرقم الهيدروجيني 8.5 ، لتعطيل الرابط المتبقي. بعد ذلك ، أعد تعليق الخرزات في مليلتر واحد من نفس المخزن المؤقت ، وقم بتدويرها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

بعد تكوير الخرز ، أعد تعليقها في 500 ميكرولتر إضافي من المخزن المؤقت. الخرزات المحضرة مستقرة لعدة أشهر عند أربع درجات مئوية. لتحضير محللات الخلية ، أعد تعليق 500 ميكرولتر من حجم الخلية المعبأة في 2.5 مل من LAP 300 ، مع 0.5 ملليمولار DTT ومثبطات البروتياز.

أضف 90 ميكرولترا من 10٪ نونوكسي بولي إيثوكسيليثانول ، واخلطها عن طريق الانعكاس. ضعي الخليط على الثلج لمدة 10 دقائق. جهاز طرد مركزي عند 21 ، 000 مرة جم لمدة 10 دقائق.

بعد الطرد المركزي ، اجمع هذا المادة الطافية منخفضة السرعة واترك جانبا عينة 10 ميكرولتر لتحليل الجل. بعد نقل المادة الطافية منخفضة السرعة إلى أنبوب TLA 100.3 ، قم بالدوران عند 100 ، 000 مرة جم لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية. اجمع هذا المادة الطافية عالية السرعة في أنبوب وضعها على الثلج ، واحتفظ بعينة 10 ميكرولتر لتحليل الجل.

للحصول على أول التقاط تقارب من خلال الارتباط بالخرز المضاد ل GFP ، قم بإزالة الخرز المقترن بالأجسام المضادة مسبقا عن طريق غسلها ثلاث مرات باستخدام مليلتر واحد من محلول الشطف لإزالة الأجسام المضادة غير المقترنة وتقليل الخلفية. قم بإجراء هذا بسرعة. لا تترك الخرز في الملح العالي لفترة طويلة.

بعد ذلك ، اغسل الخرزات ثلاث مرات بمليلتر واحد من LAP 200 N.Next ، امزج المستخلص الطافي عالي السرعة مع حبات الأجسام المضادة لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية. بعد الطرد المركزي للمستخلص عند 21 ، 000 مرة جم لمدة 10 دقائق ، احتفظ بعينة 10 ميكرولتر من المادة الطافية لتحليل الهلام. قم بإجراء ثلاث غسلات سريعة للحبات باستخدام مليلتر واحد من LAP 200 N ، يحتوي على 0.5 ملليمولار DTT ومثبطات البروتياز.

استخدم نفس المخزن المؤقت لغسل الخرزات مرتين إضافيتين مع وقت حضانة لمدة خمس دقائق لكل غسلة. بعد ذلك ، اغسل الخرزات بسرعة مرتين أخريين باستخدام 1 مليلتر من LAP 200 N يحتوي على 0.5 ملليمولار DTT ولا مثبطات للبروتياز ، قبل إضافة فيروس حفر التبغ ، أو TEV ، البروتياز. أضف 10 ميكروغرام من بروتياز TEV في مليلتر واحد من LAP 200 N إلى الخرزات ، وقم بتدوير الأنابيب عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.

في اليوم التالي ، قم بتكسير الخرز وانقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. اشطف الخرزات مرتين باستخدام 160 ميكرولتر من LAP 200 N ، التي تحتوي على 0.5 مللي مولار DTT ومثبطات البروتياز لإزالة أي بروتين متبقي. للحصول على التقاط التقارب الثاني من خلال الارتباط ببروتين S agarose ، اغسل أنبوبا واحدا من 80 ميكرولتر من ملاط agarose بروتين S ثلاث مرات باستخدام ملليلتر واحد من LAP 200 N. أضف المادة الطافية المملوءة ب TEV إلى حبات البروتين S ، وهزها لمدة ثلاث ساعات عند أربع درجات مئوية.

بعد تكوير الخرز, اغسلها ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من LAP 200 N تحتوي على 0.5 مللي مولار DTT ومثبطات البروتياز. ثم اغسل الخرزات مرتين بمليلتر واحد من LAP 100. قم بإزالة البروتينات من agarose بروتين S عن طريق إضافة 50 ميكرولترا من 4x Laemmli العينة المؤقتة والتسخين عند 97 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

لتحديد البروتينات المتفاعلة عن طريق تحليل قياس الطيف الكتلي ، اختبر جودة التنقية عن طريق تحليل العينات التي تم جمعها بواسطة الرحلان الكهربائي لهلام دوديسيل كبريتات الصوديوم بولي أكريلاميد. وصمة عار الفضة الجل الناتجة. أيضا ، قم بإزالة اللطخة المناعية والمسبار بالأجسام المضادة المضادة ل GFP لضمان عمل التنقية الموسومة ب LAP.

لتحديد أنواع التنقية المشتركة المتكافئة والفرعية المتكافئ ، خذ عينة الشطف النهائية وافصلها بواسطة SDS-PAGE. تلطخ الجل بصبغة بروتين متوافقة مع قياس الطيف الكتلي. استئصال أبرز العصابات في الجل والمسافة بينهما لمعالجة العصابات بشكل منفصل لتحليلها بواسطة قياس الطيف الكتلي.

يظهر هنا تحليل لطخة غربية تمثيلية لعينات البروتين من خلايا LAP-Tau HEK293 غير المستحثة والناتجة عن Dox. يتم فحص الخلايا بالأجسام المضادة المضادة للتوبولين للكشف عن التحكم في تحميل Tubulin ، ويتم فحصها باستخدام anti-GFP للكشف عن بروتين Tau الموسوم ب LAP. لاحظ أن LAP-Tau يتم التعبير عنه فقط عندما يتم تحفيز الخلايا باستخدام Dox.

تم إصلاح الخلايا الفطرية التي تعبر عن LAP-Tau وتلوينها بشكل مشترك للحمض النووي والتوبولين مع الأجسام المضادة للتوبولين ، وتم تحليل التوطين الخلوي الفرعي ل LAP-Tau بواسطة الفحص المجهري الفلوري. لاحظ أن LAP-Tau يحدد في عمودي المغزل الانقسامي والمغزل أثناء الانقسام. يظهر هنا جل ملون بالفضة التمثيلية لتنقية LAP-Tau.

تمثل الممرات الوزن الجزيئي ، والليزات التي تم تطهيرها ، والتميهات النهائية. تم تشغيل العينات على جل SDS-PAGE بنسبة 4-20٪ وكان الجل ملطخا بالفضة لتصور البروتينات المنقاة. لاحظ أن النطاق المقابل ل LAP-Tau مميز بعلامة النجمة ، ويمكن رؤية العديد من النطاقات الأخرى المقابلة لبروتينات التنقية المشتركة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء خطوط خلايا مستقرة محفزة بعلامة LAP ، وكيفية إجراء عمليات تنقية كيميائية حيوية للبروتينات الموسومة ب LAP للتحليل البروتيني وتحديد شبكات تفاعل البروتين.