Name: تحليل Metagenomic من السيلاج (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: استكشف تحليل الميتاجينوميك للكشف عن المجتمعات البكتيرية في سيلاج الماشية باستخدام تقنية shotgun sequencing. تُمكّن هذه الطريقة الباحثين من تحديد البكتيريا الضارة وضمان سلامة الأعلاف الحيوانية بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

يود المؤلفون أن يشكروا أندرو بيرد على عينات السيلاج وأودري فاربوس من خدمة تسلسل إكستر لمساعدتها في إعداد مكتبات تسلسل الحمض النووي. خدمة تسلسل إكستر والمرافق الأساسية الحاسوبية في جامعة إكستر. جائزة البنية التحتية السريرية لمجلس البحوث الطبية (MR / M008924/1). صندوق ويلكوم ترست للدعم الاستراتيجي المؤسسي (WT097835MF) وجائزة ويلكوم ترست للمعدات متعددة المستخدمين (WT101650MA) وجائزة BBSRC LOLA (BB/K003240/1).

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

في حين أن في تحليل SILICO يمكن أن تعطي فكرة ممتازة إلى المجتمعات الميكروبية التي تكون موجودة ضمن العينات البيئية، فمن الأهمية بمكان أن التصنيفات التصنيفية أظهرت أن يقوم بالتعاون مع الضوابط ذات الصلة والتي تم التوصل إلى عمق مناسب من تسلسل للقبض على كامل السكان الحالي 51. مع أي تحليل الحسابية، وهناك العديد من الطرق لتحقيق هدف مماثل. الأساليب التي استخدمناها في هذه الدراسة هي أمثلة على أساليب مناسبة وواضحة، والتي تم عرضها معا لتحقيق مجموعة من التحليلات على microbiome السيلاج. وهناك مجموعة متنوعة وعدد متزايد من الأدوات والتقنيات المعلوماتية الحيوية المتاحة لتحليل البيانات metagenomic، على سبيل المثال Phylosift 8 و MetaPhlAn2 52، وهذه يجب أن يتم تقييم مسبق للتحقيق لأهميتها بالنسبة للعينة ومسا تحليلuired 53. تقتصر أساليب التحليل Metagenomic من قواعد البيانات الخاصة متاحة للتصنيف، وعمق التسلسل ونوعية التسلسل. تم إجراء معالجة بيوينفورمتيك تظاهر هنا على، آلة تعمل بالطاقة العالية المحلية؛ ومع ذلك النظم القائمة على السحابة وتتوفر أيضا. هذه الخدمات المستندة إلى سحابة تسمح لاستئجار الطاقة الحسابية اللازمة دون الحاجة للاستثمار عالية التكلفة لمحطة العمل المحلية قوية مناسبة. ومن شأن التطبيق المحتمل لهذه الطريقة هو تقييم السيلاج قبل استخدامه في الزراعة لضمان عدم وجود البكتيريا الضارة المحتملة موجودة وبالتالي منعهم من دخول السلسلة الغذائية.

Metagenomics هو تحليل مباشر من الحمض النووي تنقيته من المجتمعات البيولوجية الموجودة في العينات البيئية 1، وكان يستخدم في الأصل للكشف عن البكتيريا unculturable الموجودة في الرواسب 2. وقد استخدم على نطاق واسع Metagenomics لعدد من التطبيقات، مثل تحديد microbiome الإنسان 3، تصنيف السكان الميكروبية داخل المحيط 4 وحتى لتحليل المجتمعات البكتيرية التي تضع على آلات القهوة 5. أدى إدخال تقنيات التسلسل الجيل القادم في أكبر الإنتاجية تسلسل والإخراج. ونتيجة لذلك، أصبح تسلسل الحمض النووي أكثر اقتصادا 6 وعمق تسلسل التي يمكن القيام بها قد زاد بشكل كبير، مما metagenomics لتصبح قوية وأداة تحليلية. دفعت التعزيزات &quot;الواجهة الأمامية&quot; في الجانب العملي، الجزيئي للتسلسل metagenomic نمو فيأدوات سيليكون والمعلوماتية الحيوية المتاحة لتصنيف التصنيفية 7-9، والشرح وظيفية 10،11 و 12،13 التمثيل المرئي للبيانات تسلسل الحمض النووي. تزايد عدد المتاحة، التسلسل أولية النواة وحقيقية النواة 14 الجينوم يسمح مزيد من الدقة في تصنيف المجتمعات الميكروبية، التي تتم دائما ضد &quot;في نهاية العام&quot; قاعدة بيانات مرجعية من الجينوم متسلسلة 15. ويمكن اعتماد نهجين رئيسيين لتحليل metagenomic. طريقة أكثر تقليدية هو تحليل الجينات 16S الريباسي الترميز المنطقة من جينوم بكتيري. يتم حفظها في 16S الريباسي للغاية بين الأنواع بدائيات النوى ولكن المعارض تسع مناطق فرط متغير (V1 - V9) التي يمكن استغلالها لتحديد الأنواع 16. إدخال التسلسل الطويل (≤ 300 نقطة أساس نهاية الاقتران) يسمح لتحليل تسلسل الحمض النووي التي تغطي منطقتين شديدة متغير، ولا سيماوV3 - المنطقة V4 17. التقدم في تقنيات التسلسل الأخرى، مثل أكسفورد ثقب النانو 18 و 19 PacBIO، لا يسمح كامل الجينات 16S الريباسي لتكون متسلسلة متاخم. بينما توفر 16S الحمض النووي المؤتلف المكتبات القائمة على نهج تستهدف تحديد الأنواع وتمكن من الكشف عن عدد المنخفضة نسخة الحمض النووي الذي يحدث طبيعيا في عينات النقاء والمكتبات بندقية التسلسل تسمح للكشف عن الأنواع التي قد تحتوي على مناطق الحمض النووي التي هي إما غير amplifiable من قبل 16S الريباسي تسلسل علامة التمهيدي المستخدمة، أو بسبب الخلافات بين تسلسل قالب وتسلسل تضخيم التمهيدي كبيرة جدا 20،21. وعلاوة على ذلك، على الرغم من بلمرة الحمض النووي لديها الدقة العالية تكرار الحمض النووي، وأخطاء قاعدة يمكن مع ذلك أن يحدث خلال PCR والتضخيم، وهذه الأخطاء أدرجت يمكن أن يؤدي إلى تصنيف غير صحيحة من مصدرها الأنواع 22. التحيز في التضخيم PCR من بعدها القالبيمكن أيضا أن تحدث uences. تسلسل الحمض النووي مع محتوى GC عالية يمكن أن يكون تحت الممثلة في تجمع amplicon النهائي 23 وبالمثل التعديلات قاعدة غير طبيعية، مثل غليكول الثايمين، يمكن وقف بلمرة الحمض النووي تسبب الفشل في التضخيم من الحمض النووي تسلسل 24. في المقابل، مكتبة الحمض النووي بندقية التسلسل هي مكتبة الحمض النووي التي تم إعدادها باستخدام كل من الحمض النووي المنقى الذي تم استخراجه من عينة ومجزأة في وقت لاحق إلى أطوال سلسلة أقصر الحمض النووي قبل التحضير لالتسلسل. وأكثر دقة مقارنة تصنيف التصنيفي للتسلسل الحمض النووي التي تم إنشاؤها بواسطة تسلسل طلقات نارية على 16S الريباسي amplicon التسلسل 25، على الرغم من أن التكلفة المالية المطلوبة للوصول إلى عمق التسلسل موثوق هو أعظم من ذلك من amplicon تسلسل 26. الفائدة الرئيسية من metagenomics بندقية التسلسل هو أن المناطق متسلسلة من مختلف العوامل الوراثية في العينة متاحة للتنقيب الجينات مرة واحدة أنها كانتتم تصنيف تصنيفيا 27. ويتم تحليل Metagenomic تسلسل البيانات من قبل مجموعة متزايدة من أدوات بيوينفورمتيك. هذه الأدوات هي قادرة على أداء مجموعة واسعة من التطبيقات، على سبيل المثال، تحليل ومراقبة جودة البيانات تسلسل الخام 28، وتداخل في نهاية يقترن يقرأ 29، دي نوفو تجميع تسلسل يقرأ لcontigs والسقالات 30،31، تصنيف التصنيف والتصور تسلسل يقرأ وتجميع سلاسل 7،12،32،33 والشرح وظيفية من متواليات تجميعها 34،35. السيلاج، التى ينتجها المزارعون في جميع أنحاء العالم من الحبوب المخمرة مثل الذرة (ذرة شامية)، ويستخدم في الغالب كعلف للماشية. يتم التعامل مع السيلاج مع س البكتيريا الملبنة. لمساعدة التخمير 36 ولكن حتى الآن، هناك معرفة محدودة السكان الميكروبية أخرى وجدت في السيلاج. على انزيمعملية ن يمكن أن يؤدي إلى الكائنات الدقيقة غير مرغوب فيها ويمكن أن تكون ضارة تصبح سائدة داخل السيلاج 37. بالإضافة إلى الخمائر والفطريات والبكتيريا قابلة للتكيف بشكل خاص على البيئة اللاهوائية في تخمير الأعلاف وأكثر في كثير من الأحيان ترتبط مع الأمراض في الماشية بدلا من تدهور السيلاج 38. بكتيريا حمض زبدي يمكن أن تضاف عن غير قصد من التربة لا تزال عند ملء الصوامع السيلاج وتكون قادرة على تحويل حمض اللبنيك، وهو منتج من الهضم اللاهوائي، لحامض زبدي، وبالتالي زيادة درجة الحموضة في السيلاج 39. هذه الزيادة في درجة الحموضة يمكن أن يؤدي إلى زيادة في البكتيريا التلف التي عادة ما تكون غير قادرة على مواصلة النمو في ظل السيلاج الأمثل ظروف التخمر 38. كلوستريديوم النيابة. ، الليسترية. وعصية النيابة. تثير القلق بشكل خاص، لا سيما في السيلاج كعلف للماشية الألبان، والجراثيم البكتيرية التي نجت من الاضالجهاز ointestinal 40 يمكن أن تدخل في السلسلة الغذائية، يؤدي إلى تلف المواد الغذائية و، في حالات نادرة، إلى الحيوان وفيات بشرية 37،39،41-44. وعلاوة على ذلك، في حين أنه من الصعب تقدير التأثير الاقتصادي المحدد من العلاج البيطري وفقدان الماشية الناجمة عن تلف السيلاج، فمن المحتمل أن تكون ضارة إلى مزرعة إذا كان تفشي تحدث. والافتراض بأن باستخدام نهج metagenomic يمكننا تصنيف السكان الميكروبية الموجودة في عينات الأعلاف وعلاوة على ذلك تحديد المجتمعات الميكروبية المرتبطة تلف السيلاج من شأنه، في المقابل، من المحتمل أن يكون لها تأثير ضار على الماشية، مما يتيح إجراءات تصحيحية ليكون اتخذت قبل السيلاج لاستخدامه كمصدر للغذاء.

<table><tbody><tr><td>FastDNA SPIN Kit للتربة</td><td>MP Bio</td><td>116560200</td><td>استخراج الحمض النووي</td></tr><tr><td>FastPrep</td><td>MP Bio</td><td>116004500</td><td>استخراج الحمض النووي</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP حبات</td><td>بيكمان كولتر</td><td>A63880</td><td>تنقية الحمض النووي</td></tr><tr><td>العازلة</td><td>Qiagen</td><td>19806</td><td>تنقية</td></tr><tr><td>الحمض النووي كيوبيت مقياس الفلور</td><td>ثيرمو فيشر</td><td>Q33216</td><td>الحمض النووي القياس الكمي</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32854</td> قياس <td>الحمض النووي</td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Library Prep Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>إعداد المكتبة</td></tr><tr><td>Nextera XT Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td>إعداد المكتبة</td></tr><tr><td>TapeStation 2200</td><td>Agilent</td><td>G2964AA</td><td>DNA</td></tr><tr><td>Measurement HS D100 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5584</td><td>الكمي للحمض النووي</td></tr><tr><td>HS D100 كواشف ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5585</td> الكمي <td>للحمض النووي</td></tr><tr><td>TapeStation Tips</td><td>Agilent</td><td>5067-5153</td> قياس <td>الحمض النووي</td></tr><tr><td>TapeStation Tubes</td><td>Agilent</td><td>401428 و 401425</td><td>DNA Quantitative</td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td></td><td>DNA Sequencing - مقدمة من أ خدمة التسلسل</td></tr><tr><td>محطة عمل تحليل الطاقة</td><td>العالية نظام محلي أو سحابي</td><td></td> مختلف ، <td>النظام المفضل لدى المستخدم</td></tr></tbody></table>

تحليل metagenomic من السيلاج

Metagenomic Analysis of Silage

يتم تعريف Metagenomics على أنه التحليل المباشر للحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA) المنقى من العينات البيئية ويتيح التحديد التصنيفي للمجتمعات الميكروبية الموجودة بداخلها. يوجد نهجان رئيسيان للميتاجينوم. تسلسل منطقة ترميز الجينات 16S rRNA ، والتي تظهر تباينا كافيا بين الأصناف لتحديد الهوية ، وتسلسل البندقية ، حيث يتم تحليل جينومات الكائنات الحية الموجودة في العينة وإسنادها إلى "الوحدات التصنيفية التشغيلية" ؛ الأنواع أو الأجناس أو العائلات حسب مدى تغطية التسلسل. 
 في هذه الدراسة ، تم استخدام تسلسل البندقية لتحليل المجتمع الميكروبي الموجود في سيلاج الماشية ، إلى جانب مجموعة من أدوات المعلوماتية الحيوية لفحص الجودة وتصفية قراءات تسلسل الحمض النووي ، وإجراء تصنيف تصنيفي للمجموعات الميكروبية الموجودة داخل السيلاج الذي تم أخذ عينات منه ، وتحقيق التعليق التوضيحي الوظيفي للتسلسلات. تم استخدام هذه الطرق لتحديد البكتيريا الضارة المحتملة الموجودة داخل السيلاج ، وهو مؤشر على تلف السيلاج. إذا لم يتم معالجة السيلاج الفاسد ، فقد يكون قاتلا للماشية عند تناوله.

قبل تجهيزها بيوينفورمتيك، تسلسل الخام يقرأ وقلص وأزيلت محولات باستخدام برنامج Trimmomatic 28. بعد خطوة وتقليم وتصفية، وعدد من يقرأ تم تخفيضها إلى 50٪ من تسلسل يقرأ (الجدول 1). وكان متوسط النقاط الأساسية PHRED&gt; 30 بعد مراقبة الجودة (الشكل 2). أزواج من تسلسل الحمض النووي الذي كان تم دمج مناطق متداخلة باستخدام برنامج فلاش 29 لتوليد يعد احد يقرأ، غير متداخلة يقرأ تم الاحتفاظ بها في ملف منفصل. يقرأ 45.47٪ (105343) جنبا إلى جنب بنجاح. بعد تداخل من يقرأ باستخدام FLASH من يقرأ، شظايا بمد الناتجة خضعت تصنيف التصنيفية البكتيرية باستخدام برنامج كراكن 7 وكانت تصور في وقت لاحق مع برنامج الكرونا (الشكل 3). . في غضون الصفحات = "1"&gt; تم العثور على معظم الأنواع البكتيرية الموجودة في metagenome السيلاج خلال 4 من الكائنات الحية في بدائيات النواة: افيرميكوتس (34٪)، شعاويات (28٪)، متقلبات (27٪) وعصوانيات (7٪) . يمكن أن ينظر إلى توزيع الطبقات موجودة داخل هذه الشعب في الشكل (4). كانت الأنواع الأكثر وفرة في metagenome الملبنة النيابة. (24٪، افيرميكوتس)، الوتدية النيابة. (8٪، شعاويات)، بروبيونيباكتيريوم النيابة. (3٪، شعاويات) وPrevotella النيابة. (3٪، عصوانيات). وقد لوحظت أيضا الأنواع الهامة لصحة الحيوان والمتورطين في المرض؛ كلوستريديوم النيابة. (1٪) عصية النيابة. (0.6٪)، الليسترية. ويتوقع أن تكون موجودة في عينة السيلاج (0.2٪). تم تنفيذ الشرح وظيفية على تجميعها يقرأ. تم تجميع metagenome باستخدام المجمع البستوني 30 باستخدام قطع وتصفيتهاإقران نهاية وأونبايريد يقرأ توليد 92284 السقالات. من أجل تحديد السليلوزات، وتوقع البروتينات باستخدام MG-راست وشرحها باستخدام قاعدة بيانات الانزيمات الكربوهيدرات النشطة (CAZy). من البروتينات توقع 97562، والمشروح 6357 كما انزيم المفترض الكربوهيدرات الفعالة في واحدة من الانزيمات الطبقات الخمس التي تشكل قاعدة بيانات CAZy (الشكل 5). وتصور النتائج بمثابة مخطط فين باستخدام برنامج InteractiVenn 50 تبين توزيع الشروح البروتين بما في ذلك تلك التي تحتوي على أكثر من CAZy الطبقة انزيم الشرح. من هؤلاء، كان من المتوقع أن يكون 3861 النشاط هيدرولاز الأنتراكينون والتي سيتواصل تميزت في المختبر للتأكد من وظيفة. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig1.jpg"> الشكل 1: بيوينفورمتيك Metagenomics خط أنابيب لتحليل الأعلاف. كانت نهجين رئيسيينتستخدم للتحقيق في microbiome من السيلاج، تصنيف التصنيف والشرح وظيفية. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig2.jpg"> الشكل 2: تسلسل الجودة لكل قاعدة قبل وبعد التشذيب وإزالة محول. تسلسل جودة مؤامرة لكل قاعدة من FASTQC يبين متوسط ​​درجة PHRED عبر طول تسلسل يقرأ السيطرة قبل وبعد الجودة. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig3.jpg"> الشكل (3): التصنيفي Classificaنشوئها من البكتيرية Microbiome من السيلاج الصلبة. تصنيف تسلسل قلصت وتداخل يقرأ من تم تنفيذ FLASH باستخدام كراكن 7 و تصور في وقت لاحق مع الكرونا. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig4.jpg"> الشكل 4: توزيع الفئة التصنيفية للمن الكائنات الحية 4 الأكثر وفرة في البكتيرية Microbiome من السيلاج الصلبة. نسبة كل فئة من البكتيريا داخل من الكائنات الحية الأربعة الأكثر وفرة. افيرميكوتس: المطثيات (الحمراء)، والعصيات (الأزرق الداكن)؛ متقلبات: دلتا / إبسيلون (وردي)، ألفا (شاحب اللون الأزرق) وغاما (برتقالي) وبيتا (الفيروز)؛ عصوانيات: Flavobacteriia (الأزرق الداكن) وBacteroidia(أخضر باهت)؛ شعاويات: Coriobacteriia (الأرجواني الداكن) وغيرها من شعاويات (الأخضر الداكن). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/54936/54936fig5.jpg"> الرقم 5: CAZy الشرح للبروتيوم توقع في صلب علف Microbiome. فين رسم بياني يوضح توزيع الطبقات انزيم خمسة من الشروح CAZy في بروتيوم توقع من microbiome السيلاج الصلبة. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54936/54936fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> يقرأ # الخام </td><td rowspan="2"> # المصفاة يقرأ (الاقتران) </td> يقرأ # المصفاة <td rowspan="2"> # تومض يقرأ </td></tr><tr><td> (الاقتران) </td><td> (المفردة) </td></tr><tr><td> 2374949 X2 </td><td> 231679 X2 </td><td> 1892534 </td><td> 105343 </td></tr></tbody></table> الجدول 1: يقرأ جدول ملخص التسلسل.

تم استخدام Metagenomics للتحقيق في ميكروبيوم علف ماشية السيلاج. تم إجراء التحليل عن طريق تسلسل البندقية. تم استخدام هذا النهج لتوصيف تكوين المجتمع الميكروبي داخل علف الماشية.

تحليل Metagenomic من السيلاج

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

الهدف العام من هذه التجربة هو فهم المجتمع البكتيري الموجود داخل عينة السيلاج ، على الرغم من أنه يمكن تطبيق هذه الإجراءات على مجموعة من أنواع العينات المختلفة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية عند تحديد المجتمعات بدائية النواة الموجودة داخل الأنظمة الميكروبية المعقدة ، كما هو الحال في الحالة المعروضة هنا ، السيلاج لتغذية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يتم استخدام تسلسل البندقية بدلا من تسلسل أمبليكون 16S الأكثر تقليدية ، مما يتيح دقة أكبر بكثير عند تصنيف الميكروبيوم.يمكن تطبيق هذه الطريقة على مجموعة واسعة من العينات الأخرى حيث قد تتشكل عوالم مصغرة معقدة ، كما هو الحال في الأمعاء البشرية ، أو على سطح الجلد ، أو في عينات المياه ، أو حتى حول ماكينة القهوة في المكتب. يتم استخدام مجموعة تجارية لاستخراج الحمض النووي من عينة السيلاج. ابدأ هذا الإجراء بإضافة 100 إلى 400 ملليغرام من العينة إلى 978 ميكرولتر من محلول فوسفات الصوديوم و 122 ميكرولتر من محلول تحلل التربة في أنبوب التحلل المزود.قم بتضمين عنصر تحكم سلبي لا يحتوي على عينة السيلاج. قم بتجانس العينات عن طريق وضع أنابيب التحلل في الخالط لمدة 40 ثانية بسرعة 6.0 متر في الثانية. جهاز الطرد المركزي للمحللات لمدة 15 دقيقة.انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف يحتوي على 250 ميكرولتر من محلول ترسيب البروتين واخلط المحلول عن طريق التقليب 10 مرات. ثم جهاز الطرد المركزي لمدة خمس دقائق. انقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 15 ملليلتر يحتوي على مليلتر واحد من مصفوفة ربط الحمض النووي.امزج المحلول عن طريق قلب الأنبوب باستمرار لمدة ثلاث دقائق. اتركي الخليط يستقر لمدة ثلاث دقائق ، ثم تخلصي من 500 ميكرولتر من المادة الطافية واخلطي المادة الطافية المتبقية عن طريق سحب العينات. انقل 600 ميكرولتر من التعليق إلى مرشح الدوران وجهاز الطرد المركزي عند 14،000 مرة G لمدة دقيقة واحدة.تخلص من المرشح وكرر العملية مع التعليق المتبقي. بعد التخلص من المرشح ، أضف 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل إلى مصفوفة ربط الحمض النووي داخل مرشح الدوران ، واخلطها عن طريق سحب العينات ، وأجهزة الطرد المركزي عند 14،000 مرة G لمدة دقيقة واحدة. تخلص من المرشح وقم بالطرد المركزي بفلتر الدوران لمدة دقيقتين لضمان إزالة كل مخزن الغسيل المؤقت.جفف مرشح الدوران على حرارة 23 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. أضف 100 ميكرولتر من الماء الخالي من DNase الدافئ مسبقا إلى مصفوفة ربط الحمض النووي وانقل مرشح الدوران إلى أنبوب نظيف من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل. جهاز طرد مركزي عند 14 ، 000 مرة G لمدة دقيقة واحدة لمسح الحمض النووي.قم بتخزين الحمض النووي عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى الحاجة لمزيد من التحليل. سيتم تنقية الحمض النووي المستخرج من عينات السيلاج باستخدام حبات تنقية الحمض النووي. أخرجي الخرزات من الثلاجة واتركيها على حرارة 23 درجة مئوية قبل 30 دقيقة على الأقل من الاستخدام.أضف مجلدين من الخرز إلى كل عينة من الحمض النووي واحتضان المحلول عند 23 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ضع العينات على مغناطيس فصل لمدة خمس دقائق ثم تخلص من المادة الطافية. اغسل الخرزات مرتين ب 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 80٪.جفف الخرزات بالهواء لمدة 10 دقائق يجب أن تكون الخرزات جافة بدرجة كافية ، ولكن لا تجف أكثر من اللازم ، لذلك من الضروري فحص الخرزات بصريا قبل المتابعة. قم بإزالة العينات من مغناطيس الفصل ، وأضف 50 ميكرولترا من محلول الشطف ، واخلطها عن طريق سحب العينات. احتضان المعلق عند 23 درجة مئوية لمدة خمس دقائق ، ثم ضع العينات مرة أخرى على مغناطيس الفصل لمدة ثلاث دقائق.انقل المادة الطافية التي تحتوي على الحمض النووي إلى أنبوب نظيف وتخلص من الخرز. لبدء هذا الإجراء ، قم بإعداد حل عملي باستخدام نسبة 199 إلى واحدة من المخزن المؤقت إلى الكاشف. أضف 10 ميكرولتر من كل معيار DNA إلى 190 ميكرولتر من محلول العمل.أضف 10 ميكرولترات من الحمض النووي المنقى إلى 190 ميكرولتر من محلول العمل. احتضان عينات الحمض النووي القياسية عند 23 درجة مئوية لمدة دقيقتين. بعد ذلك ، قم بتحليل المعايير قبل عينات الحمض النووي على مقياس الفلور باتباع التعليمات التي تظهر على الشاشة.من الضروري أن يكون الحمض النووي المنقى ذا نوعية جيدة ومحددا بدقة ، لذلك إذا كان هناك أي شك بشأن جودة وتركيز الحمض النووي ، فيجب تكرار استخراج الحمض النووي. يتم إعداد مكتبة تسلسل البندقية باستخدام مجموعة أدوات إعداد المكتبة التجارية. خفف عينات الحمض النووي إلى 0.2 نانوجرام لكل ميكرولتر باستخدام المخزن المؤقت للشطف.امزج خمسة ميكرولترات من الحمض النووي المنقى مع 10 ميكرولترات من المخزن المؤقت للعلامات وخمسة ميكرولترات من مزيج إنزيم العلامات. احتضان العينات عند 55 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. أضف خمسة ميكرولترات من المخزن المؤقت المحايد لكل عينة واحتضان المحلول عند 23 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.بعد ذلك ، أضف خمسة ميكرولترات من كل مؤشر من مؤشرات التسلسل الخاصة بالعينة و 15 ميكرولترا من تفاعل البوليميراز المتسلسل الرئيسي. ضع العينات في جهاز تدوير حراري وقم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). قم بتنقية الحمض النووي المحضر باستخدام طريقة تنقية الخرزة كما هو موضح سابقا ، ولكن مع شطف نهائي يبلغ 30 ميكرولترا من المخزن المؤقت للشطف.بعد ذلك ، يتم تسلسل الحمض النووي واستخدام مجموعة من أدوات المعلوماتية الحيوية لتحليل بيانات التسلسل كما هو موضح في بروتوكول النص. تم إجراء التصنيف التصنيفي للميكروبيوم البكتيري باستخدام برنامج Kracken ثم تم تصوره باستخدام برنامج CHROMA. تم العثور على غالبية الأنواع البكتيرية الموجودة في ميتاجينوم السيلاج داخل أربعة فيلا بدائية النوايا ، وثابتة عند 34٪ بكتيريا شعاعية عند 28٪ بكتيريا بروتيوية بنسبة 27٪ والتهاب العصيات عند 7٪ يشار أيضا إلى توزيع الفئات الموجودة داخل هذه الفيلا.نتج عن التعليقات التوضيحية الوظيفية التي تم إجراؤها على القراءات المجمعة 6،357 بروتينا متوقعا مشروحا على أنه إنزيم نشط مفترض للكربوهيدرات وواحدة من فئات الإنزيمات الخمس التي تشكل قاعدة بيانات الإنزيمات النشطة للكربوهيدرات. يوضح مخطط Venn هذا توزيع التعليقات التوضيحية للبروتين ، بما في ذلك تلك التي تحتوي على أكثر من تعليق توضيحي لفئة الإنزيم. من بين هؤلاء ، تم توقع أن يكون لدى 3،591 نشاط هيدرولاز جليكوزيد.بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال إعداد مكتبات تسلسل الحمض النووي في يوم واحد إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم التأكد من عدم وجود تلوث متبادل بين العينات واستخدام أدوات التحكم المناسبة دائما مثل الفراغ. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء تحليلات حيوية أخرى من أجل التحقق من صحة التصنيفات التي أجراها كراكين.تمكن تقنيات الميتاجينومية هذه الباحثين من استكشاف الميكروبيوم في العديد من الأنظمة المعقدة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد مكتبات تسلسل الحمض النووي الميتاجينومي وإجراء تحليلات المعلوماتية الحيوية على قراءات تسلسل الحمض النووي التي تم الحصول عليها. لا تنس أن العمل مع كواشف ربط الحمض النووي يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما ارتداء الاحتياطات مثل القفازات ومعاطف المختبر أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

Research

JoVE Journal

Genetics

علم الوراثة

في هذا البروتوكول التعبير الجيني ، في الخميرة...

تحليل لميكروأري السكيراء الجعوية</em

باستخدام التليف الكيسي الهوائية كمثال على ذلك، تقدم المخطوطة سير عمل شامل يضم مجموعة من النهج ميتاجينومية وmetatranscriptomic لتوصيف الجرثومية والفيروسية المجتمعات في عينات المرتبط الحيوان.

تنقية انجاس: تسلسل Metagenomes وMetatranscriptomes من مجمع عينات المرتبط الحيوانية

اتحادات الميكروبية داخل خلايا النحل تلعثم إثراء والحفاظ على حبوب اللقاح ليرقات النحل. باستخدام تسلسل الجيل القادم، جنبا إلى جنب مع المختبرات والتجارب الميدانية، وهذه المخطوطة يصف البروتوكولات المستخدمة لاختبار الفرضية القائلة بأن بقايا مبيد للفطريات تغير ميكروبيومي حبوب اللقاح، ومستعمرة التركيبة السكانية، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى مستعمرة الخسارة.

التجريبية ومواد وتقنيات حسابية إلقاء الضوء على الآليات "مبيدات الفطريات وسط النحل الصحية"

تكنولوجيا نانوبوري لتسلسل الجزيئات الحيوية لها تطبيقات واسعة في مجال علوم الحياة، بما في ذلك تحديد مسببات الأمراض ورصد سلامة الأغذية، وتحليل الجينوم، ميتاجينوميك الرصد البيئي، وتوصيف للبكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية. ويتجلى في هذه المقالة، إجراءات الجينومية التربة تسلسل الحمض النووي لتحديد الأنواع باستخدام تكنولوجيا التسلسل نانوبوري.

نانوبوري تسلسل الحمض النووي لتحليل التربة الجينومية

هنا، يمكننا وصف بروتوكول للحصول على بيانات تسلسل amplicon التربة ورهيزوسفيري وميكروبيوميس اندوسفيري الجذر. هذه المعلومات يمكن استخدامها للتحقيق في تركيبة وتنوع المجتمعات الميكروبية النباتية المرتبطة، وهي مناسبة للاستخدام مع مجموعة واسعة من الأنواع النباتية.

استكشاف ميكروبيومي الجذر: استخراج البيانات المجتمع البكتيرية من التربة، ورهيزوسفيري، واندوسفيري الجذر

نقدم هنا، وضع بروتوكول لإعداد عينات من الحمض النووي من المواد الغذائية والبيئية ميكروبيوميس لكشف متضافرة و subtyping السالمونيلا عن طريق التسلسل كواسيميتاجينوميك. الاستخدام المشترك لإثراء الثقافة والفصل إيمونوماجنيتيك (IMS) والتشرد متعددة يسمح التضخيم (MDA) فعالية تركيز الحمض النووي السالمونيلا من غذاء والعينات البيئية.

تحليل شبه الجينومية السالمونيلا من غذاء والعينات البيئية

ويصف هذا البروتوكول سرعة نقل واحد للتقنيات التحليلية واوميكس تكميلية بلغت ذروتها في توصيف إقران تماما من المواد العضوية الطبيعية والبروتينات الميكروبية في النظم الإيكولوجية المختلفة. ويسمح هذا النهج مقارنات قوية لتحديد المسارات الأيضية والتحولات الهامة لوصف إنتاج غازات الدفيئة والتنبؤ بالاستجابات للتغير البيئي.

واحد الإنتاجية التكميلية التقنيات التحليلية عالية الدقة لوصف خليط معقد من المواد العضوية الطبيعية

هنا ، نقدم بروتوكولا لوصف amplicon metagenomic لتحديد المجتمع البكتيري لعنب Traminette والعنب المخمر والنبيذ النهائي.

تنميط المجتمع البكتيري لتخمير عنب الترامينيت أثناء إنتاج النبيذ باستخدام تسلسل الأمبليكون الميتاجينومي

&lt; p class = "jove_content" &gt; يتم تقديم طريقة لتحليل التمثيل الغذائي للشعير. تستلزم الطريقة تجزئة واشتقاق المستقلبات وتحليلها بواسطة كروماتوغرافيا الغاز / قياس الطيف الكتلي (GC / MS). يمكن استخدام التحليل الأيضي لتحديد تأثير الزراعة البينية وإجهاد الجفاف على الحبوب.

التحليل الأيضي للشعير بواسطة كروماتوغرافيا الغاز / قياس الطيف الكتلي

يتيح هذا البروتوكول تقييما سريعا وفعالا من حيث التكلفة للتركيب الميكروبي في منتجات الألبان من خلال الجمع بين الثقافات ومرض التصلب العصبي المتعدد. إنه يقدم نتائج تصنيف مماثلة لتسلسل 16S rRNA مع وقت استجابة أقصر من طرق الثقافة التقليدية.

تقييم السلامة الميكروبية لمصانع الألبان باستخدام التنميط البروتيني البكتيري عبر نهج MALDI

استكشف تحليل الميتاجينوميك للكشف عن المجتمعات البكتيرية في سيلاج الماشية باستخدام تقنية shotgun sequencing. تُمكّن هذه الطريقة الباحثين من تحديد البكتيريا الضارة وضمان سلامة الأعلاف الحيوانية بدقة عالية.

تحليل Metagenomic من السيلاج

استكشف المزيد من الفيديوهات