هندسة العوامل الاصطناعي للتلاعب على وجه التحديد الربط البديل في الخلايا البشرية

الهدف العام من هذا البروتوكول هو هندسة عوامل التضفير الاصطناعية التي يمكنها على وجه التحديد معالجة التضفير البديل لهدف معين. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال معالجة الحمض النووي الريبي ، مثل تنظيم التضفير البديل في الخلايا السرطانية وسوء تنظيمه. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي مرونتها.

يمكننا تصميم عوامل اصطناعية تعزز أو تمنع أنواعا مختلفة من التضفير البديل في أي جينات معينة. سيظهر هذا الإجراء Huan-Huan ، باحث مشارك في مختبري ، و Qianyun ، باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري. يتم استخدام الحمض النووي PUF من النوع البري كقالب لإنشاء سقالة مجال PUF المخصصة.

استخدم بادئات PCR التي تحتوي على تسلسلات PUF التي تتعرف على وجه التحديد على نيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي المختلفة في كل موضع. لكل تكرار PUF ، استخدم أربعة بادئات مختلفة للتعرف على قاعدة مختلفة في كل موضع. في الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل ، استخدم أزواج التمهيدي الموضحة لإنشاء تسلسلات ترميز لأربعة تكرارات PUF ، وشظايا جسر عالمية ، وشظايا غطاء.

في الجولة الثانية ، استخدم منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل التي تم إنشاؤها في الخطوة الأخيرة كقوالب مع مجموعات التمهيدي المعروضة لإنشاء تسلسلات ترميز لرموز التعرف على الحمض النووي الريبي من R-one إلى R-four ، و R-five إلى R-eight. في الجولة الثالثة ، استخدم المنتجات من الجولة الثانية والجسر من أربعة إلى خمسة كقوالب باستخدام التمهيدي الأمامي R-one والتمهيدي العكسي R-eight لإنشاء تسلسلات ترميز ل R-one إلى R-eight بدون أغطية. في الجولة الرابعة من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، استخدم R-one إلى R-eight، وغطاء نهاية خماسي رئيسي خماسي، وغطاء نهاية ثلاثي الحروف كقوالب، لإنشاء تسلسلات تشفير لنطاقات PUF الكاملة.

لبدء تعداء خلايا HEK-293T ، امزج كاشف التعدي الشحمي عن طريق قلب الزجاجات برفق. ثم قم بتخفيف ميكرولترين من كاشف التعدي الشحمي في 50 ميكرولتر من وسط المصل المخفض لكل تعداد. تخلط برفق ، ثم تحتضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك ، قم بتخفيف 04 ميكروغرام من ناقل التعبير في المجال الغني بالجليسين ، و 0.2 ميكروغرام من بلازميد مراسل الربط المعياري في 50 ميكرولترا من وسط المصل المخفض في أنبوب معقم. ثم قم بتخفيف 0.4 ميكروغرام من ناقل التعبير في مجال مستجيب RS ، و 0.2 ميكروغرام من بلازميد PGZ-three reporter في 50 ميكرولتر من وسط المصل المخفض. أخيرا ، قم بتخفيف 0.4 ميكروغرام من ناقل التعبير PGL-RS-PUF و 0.2 ميكروغرام من بلازميدات مراسل PEZ-1B أو PEZ-2F في 50 ميكرولتر من وسط المصل المخفض في أنبوب معقم.

بعد خمس دقائق من الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، امزج كاشف التعداء الشحمي المخفف برفق مع مخاليط البلازميد المخففة. احتضن الخلطات النهائية لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف مخاليط التعدي التي تحتوي على نواقل التعبير إلى كل بئر من صفيحة مكونة من 24 بئرا مصنفة بخلايا HEK-293 ، واحتضانها لمدة 12 ساعة على الأقل في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد 12 ساعة من الحضانة ، قم بحصاد الخلايا المنقولة عن طريق التربسين والطرد المركزي. بعد الطرد المركزي ، تخلص من الوسيط وأضف 0.5 مل من مخزن استخراج الحمض النووي الريبي لكل أنبوب. أضف 0.1 مل من الكلوروفورم لكل 0.5 مل من المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي الريبي لكل عينة.

بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للأنابيب لمدة 15 دقيقة عند 12،000 مرة G وأربع درجات مئوية. ثم انقل القاعدة المائية إلى أنبوب جديد. أضف 0.25 مل من الأيزوبروبانول لكل 0.5 مل من المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي الريبي المستخدم في التجانس الأولي.

تخلط عن طريق الدوامة ، وتحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. بعد الطرد المركزي كما كان من قبل ، عادة ما يكون راسب الحمض النووي الريبي مرئيا في قاع الأنبوب. تخلص من المادة الطافية ، واغسل حبيبات الحمض النووي الريبي ب 0.5 مل من 75٪ إيثانول لكل 0.5 مل من المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي الريبي.

دوامة بقوة ، ثم أجهزة الطرد المركزي عند 7 ، 500 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد الدوران ، قم بإزالة المادة الطافية ، وجفف كريات الحمض النووي الريبي في الهواء. قم بإذابة الحمض النووي الريبي في 50 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase.

بعد ذلك ، أضف ميكرولترين من خمس وحدات لكل ميكرولتر DNase واحد ، وسبعة ميكرولترات من 10X مخزن مؤقت ، و 11 ميكرولترا من الماء لكل محلول RNA سعة 50 ميكرولترا. بعد الحضانة ، قم بتسخين المحاليل إلى 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتعطيل DNase. بعد إجراء تفاعل نسخ عكسي لتصنيع (كدنا) من كل عينة ، أضف مكونات الجسم المسمى تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل بالترتيب الموضح على الشاشة إلى أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

قم بإعداد تفاعل واحد لكل عينة. قم بتشغيل برنامج RT-PCR على المدورة الحرارية. أخيرا ، قم بحل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق الرحلان الكهربائي من خلال هلام بولي أكريلاميد بنسبة 10٪ مع عازلة TBE.

استخدم ماسح ضوئي مضان لتصور المنتجات ، وقياس كمية كل شكل إسوي مقسم باستخدام برنامج قياس الكثافة. لكي يقيس مقايسة التألق المناعي موت الخلايا المبرمج ، قم بإعداد مزيج تعداء يحتوي على بلازميدات التعبير عن المجال الغنية بالجلايسين كما هو موضح سابقا ، وخلايا HeLa الشفافة المزروعة على غطاء زجاجي مطلي بالبولي يسين تنزلق في صفيحة من ستة آبار. بعد 24 ساعة من التعداء ، قم بتثبيت الخلايا الموجودة على زلات الغطاء بمليلتر واحد من 4٪ بارافورمالدهيد في 1x PBS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

ثم اغسل الخلايا برفق على زلات الغطاء بملليلترين من 1x PBS لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم باختراق الخلايا باستخدام 0.2٪ Triton X-100 في 1x PBS لمدة 10 دقائق. بعد الغسيل ثلاث مرات باستخدام 1x PBS كما كان من قبل ، قم بمنع الارتباط غير المحدد بألبومين مصل البقر بنسبة 3٪ في 1x PBS لمدة 10 دقائق.

قم بتخفيف الجسم المضاد للعلم من واحد إلى 1,000 في 3٪ BSA في PBS ، وقم بإخراج 30 ميكرولترا من الجسم المضاد للعلم المخفف على ورقة البارافيلم. استخدم الملقط لإزالة زلة الغطاء. جفف المخزن المؤقت الزائد بعناية باستخدام مناديل المختبر المبللة ، ثم ضع جانب الخلية المنزلق للغطاء لأسفل على المحلول المضاد للعلم.

احتضن لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، أضف ما يقرب من 500 ميكرولتر من 1x PBS إلى جانب الخلية من زلة الغطاء حتى تطفو فوق المحلول. أعده إلى اللوحة المكونة من ستة آبار مع 1x PBS في الآبار.

احتضان بجسم مضاد ثانوي على البارافيلم كما كان من قبل لمدة 15 دقيقة. اغسل كما كان من قبل ، ثم قم بتركيب زلات الغطاء على شرائح المجهر باستخدام وسيط التثبيت الذي يحتوي على DAPI. تصور الخلايا باستخدام المجهر الفلوري ، وتصويرها باستخدام كاميرا رقمية.

باستخدام الفحص المجهري المناعي ، كان لدى العديد من الخلايا التي تعبر عن Gly-PUF-531 حمض نووي مجزأ ، مما يشير إلى أنها كانت تخضع لموت الخلايا المبرمج. كعنصر تحكم ، كان للخلايا التي تعبر عن النوع البري Gly-PUF حمض نووي أقل تجزئة عند مقارنتها بالخلايا المنقولة Gly-PUF-531. هنا ، يظهر الفحص المجهري المناعي الفلوري باستخدام الجسم المضاد للعلم المدمج مع الخلايا الملطخة ب DAPI أن Gly-PUF-531 موضعي في الغالب في نوى الخلايا المنقولة.

النوع البري Gly-PUF مترجم أيضا في نوى الخلايا المنقولة ، مما يشير إلى أن هذه الشبكات الريفية الكفادية تنفصل عن أهدافها عندما يتم نقل الرنا المرسال المقسمة بالكامل إلى السيتوبلازم. كانت النسبة المئوية للخلايا المبرمج ذات الحمض النووي النووي المجزأ مقاييس من المجالات المختارة عشوائيا لصور المجهر الفلوري. بمجرد إتقانها ، يمكن بناء سقالات PUF ذات خصوصية ربط الحمض النووي الريبي في غضون يومين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية معالجة التضفير البديل في الخلايا البشرية على وجه التحديد عن طريق هندسة العوامل الاصطناعية.