تربية ومزدوجة الذين تقطعت بهم السبل بوساطة الحمض النووي الريبي الجينات ضربة قاضية في إخفاء بيتل، Dermestes المبقعة

الهدف العام من هذا الإجراء هو استكشاف وظيفة الجينات في Dermestes maculatus ، وهو نظام جديد لنموذج الحشرات ، والذي يمثل مجموعة متنوعة من الخنافس ، ويسهل دراسة أسئلة البحث الأساسية والتطبيقية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجالات علم الأحياء التنموي والبيولوجيا التطورية وما بعدها ، من خلال جعل من الممكن اختبار وظيفة الجينات في أجنة Dermestes والبالغين. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن استخدام تداخل الحمض النووي الريبي لاستهداف أي جين ، بناء على معلومات التسلسل فقط ، حتى في حالة عدم وجود تسلسل جينوم كامل.

لا توفر الطرق المقدمة هنا نهجا لدراسة وظيفة الجينات في Dermestes فقط. يمكن أيضا تطبيقها لتطوير أنظمة نماذج حشرية جديدة ، وربما لمكافحة الآفات الحشرية. لتحضير قفص تربية ل D.maculatus ، انشر أولا طبقة رقيقة من نشارة الخشب في قفص حشرات متوسط الحجم.

ضع جزءا من الستايروفوم في القفص للسماح لليرقات ببيئة تتشرنق فيها. أضف عشرين إلى خمسين خنفساء بالغة أو يرقات متأخرة إلى القفص. ضع طعام القطط الرطب في طبق بتري أو قارب الوزن كمصدر للغذاء.

غطي القفص بقطعة قماش شبكية وضعيه في حاضنة. قبل البدء في جمع الأجنة ، افحص القفص أولا بعناية بحثا عن أي أجنة موجودة وقم بإزالتها. بمجرد أن يصبح القفص واضحا ، ضع كرة قطنية ممدودة في القفص واحتضن المستعمرة عند 30 درجة مئوية.

بعد النافذة الزمنية المناسبة ، اجمع كرة القطن ، وقم بإزالة أي شخص بالغ موجود ، ثم ضعه مرة أخرى في القفص. فوق قطعة من ورق البناء الأسود ، اضغط على كرة القطن برفق ، وقم بتمزيقها ببطء إلى خيوط رفيعة ، بحيث يسقط أي بيض موجود على الورق الأسود. خذ غطاء طبق بتري قياسي ، واستخدم قطعة من ورق الترشيح الأسود لتغطية الداخل.

قم بلصق قطعة من الشريط على الوجهين على طول حافة شريحة المجهر القياسية. ضع شريحة المجهر على ورق الترشيح الأسود في غطاء طبق بتري. أخذ الورقة التي تحتوي على الأجنة التي تم جمعها ، واضغط برفق لنقل الأجنة إلى غطاء طبق بتري.

باستخدام فرشاة الرسم ، قم بمحاذاة الأجنة الموجودة على الشريط بشكل عمودي على الشريحة ، مع الطرف الأمامي أو الخلفي باتجاه الحافة. لبدء RNAi ، امتلك أولا 2-4 ميكرولتر من dsRNA في طرف ماصة محمل صغير سعة 20 ميكرولتر. أدخل الطرف في الشعيرات الدموية الزجاجية المسحوبة مسبقا ، يشار إليها باسم الإبرة ، وقم بإدخال المحلول برفق في الإبرة.

ثبت الإبرة في حامل شعري زجاجي ثم قم بتجميع حامل الشعيرات الدموية في المعالج الدقيق. بعد ذلك ، انقل الشريحة بعناية مع الأجنة المرفقة بمرحلة مجهر التشريح. حرك الشريحة لإحضار جنين واحد إلى وسط الحقل وتركيز المجهر.

أثناء النظر في نطاق التشريح ، ضع طرف الشعيرات الدموية باستخدام المعالج الدقيق. اجعل الطرف قريبا من نهاية الجنين الأول في الصف. قم بتشغيل مصدر النيتروجين أو الهواء ، ثم اضبط مفتاح محدد إدخال الملف اللولبي على الفراغ.

اضبط منظم ضغط الإخراج على 10-15 رطل لكل بوصة مربعة ، اعتمادا على الجهاز. افتح الشعيرات الدموية ، وسوف يملأ محلول dsRNA الملون الطرف ، وجاهزا للحقن. حرك الطرف الشعري للأمام ، وثقب الجنين برفق.

في ظل إعدادات الضغط المثالية ، لن يتدفق أي سائل جنيني إلى الشعيرات الدموية. خطوة على مفتاح القدم لإخراج dsRNA في الجنين, حتى يتم صرف الكمية المناسبة. اترك الطرف داخل الجنين لمدة ثانيتين تقريبا ، ثم قم بإزالته بعناية.

بمجرد حقن جميع الأجنة ، ضع الشريحة في طبق بتري. أضف كرة قطنية مبللة إلى الطبق ، مع الحرص على عدم تركها تتلامس مع الشريحة. غطي طبق بتري ولفه بغشاء مانع للتسرب.

قم بتسميتها بنوع dsRNA وتركيزه وتاريخه ووقته وعدد الأجنة المحقونة. أخيرا ، ضع الطبق في حاضنة على حرارة 30 درجة مئوية حتى تفقس الأجنة. لأداء pRNAi ، قم أولا بجمع الشرانق من المستعمرة.

قم بفرز الشرانق من الذكور والإناث في طبقين منفصلين ، وضعها في حاضنة 30 درجة مئوية. افحص الأطباق يوميا بحثا عن الخنافس المغلقة ، وانقل هؤلاء الأفراد إلى طبقين منفصلين من بتري للبالغين من الذكور والإناث أطعم هؤلاء البالغين وحافظ على الأطباق كل يومين ، حتى يغلق عدد كاف من البالغين لبدء الحقن.

بمجرد اكتمال حمام السباحة البالغ ، قم بتخدير أنثى الخنفساء ، وامسك الجانب البطني الفردي لأعلى بيد واحدة ، مع إمساك المحقنة في اليد الأخرى. اخترق بلطف غشاء segmacoria بين السترنيتس 2 و 3. تحقق من مقياس المحقنة وقم بتوزيع حوالي ميكرولتر ببطء لكل أنثى.

بعد الحقن ، أمسك الإبرة بثبات لمدة 5 ثوان على الأقل ثم اسحبها بعناية. انقل الإناث المحقونة إلى طبق بتري مع طعام القطط. قم بتسمية الطبق بشكل مناسب.

ضع الطبق في حاضنة 30 درجة مئوية. بعد 24 ساعة ، انقل الإناث المحقونات إلى قفص صغير ، وأضف عددا متساويا من الذكور الصغار غير المحقونين. قم بتسمية القفص وأضف طعام القطط.

ضع القفص في حاضنة 30 درجة مئوية للسماح بالتزاوج. يمكن بعد ذلك فحص النسل الناتج لتحديد تأثيرات pRNAi. تظهر هذه الصورة ذرية لفرد pRNAi تم حقنه ب DS GFP ، وهو بروتين الفلورسنت الأخضر كعنصر تحكم.

هنا ، كما هو الحال مع الأفراد من النوع البري ، يفقس النسل بشريط مصطبغ واحد لكل جزء. تم فصل الخطوط المصطبغة المجاورة بفجوة غير مصطبغة. بعد pRNAi المزدوج ، فقس النسل المصاب بخطوط مصطبغة مجاورة مدمجة ، مما يشير إلى حدود قطاعية معيبة.

كانت شدة النمط الظاهري متغيرة ، لكن الاندماجات ظهرت باستمرار في مناطق حدودية معينة ، مما يشير إلى قاعدة الزوج مثل العيوب. وبالمثل ، أظهرت الأنماط الظاهرية للبشرة للأجنة غير المفرغة بعد الضربة القاضية المزدوجة فقدان أجزاء البطن ، بالإضافة إلى تقصير طول الجسم. أظهر تلطيخ الأجنة المبكرة بجسم مضاد منقوش لفحص العيوب الجزيئية خطوط تعبير متساوية الكثافة في كل جزء في الأفراد الضابطين.

في المقابل ، تم الكشف عن انخفاض التعبير في خطوط بديلة في نسل إناث dsRNA المقترنة Dmac. يتوافق هذا النمط من التعبير المنخفض مع نمط البشرة المعيب الذي لوحظ في اليرقات المصابة المفرغة. هنا ، ولأول مرة ، نقدم بروتوكولنا لإسقاط جين ذي أهمية ، أثناء التطور الجنيني المبكر في Dermestes maculatus ، باستخدام تداخل الحمض النووي الريبي.

أثناء محاولة هذه الإجراءات ، من المهم أن تتذكر استخدام الأجنة أو الإناث البالغات في المرحلة المناسبة. بمجرد إتقان ، يمكن حقن حوالي 100 جنين أو 10 إناث بالغات في غضون نصف ساعة. بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، مثل تلطيخ الأجنة أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية حول آليات تنظيم الجينات.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء مستعمرة مختبر Dermestes ، وإجراء تداخل الحمض النووي الريبي الجنيني والأبوي في هذه الخنفساء. حاليا ، يتوفر عدد قليل فقط من نماذج الحشرات للدراسات الوظيفية. تمهد التقنيات المعروضة هنا الطريق للباحثين لاستخدام Dermestes كنظام نموذجي ، مما يوسع نطاق الحشرات القابلة للتحليل الجيني الجزيئي.