ثقافة الفئران الجنينية الأمشاط: نموذج الفسيولوجي من غضروفي التعظم

الهدف العام من هذا الإجراء هو تشريح واستزراع مشط القدم من الفئران الجنينية لتوفير نموذج خارج الجسم الحي للسماح بدراسة نمو العظام الغضروفي وتمعدنها. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول التعظم الغضروفي ، وهي العملية التي تنمو بها العظام الطويلة. على وجه الخصوص ، من المناسب تماما التحقيق في آليات بدء تمعدن الهيكل العظمي.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر ، من خلال الحفاظ على تفاعلات الخلية إلى الخلية ومن الخلية إلى المصفوفة ، نموذجا فسيولوجيا أكثر للتعظم الغضروفي مقارنة بالخلايا في ثقافة 2D أو 3D. للبدء ، قم بإعداد وسيط التشريح عن طريق تخفيف الحد الأدنى من الوسائط الأساسية ألفا من واحد إلى 13 في PBS. بعد ذلك ، أعد تعليق BSA بمعدل ملليغرام لكل مليلتر ثم قم بتعقيمه من خلال مرشح حقنة.

بعد ذلك ، قم بإعداد وسط الاستزراع وقم بتعقيمه باستخدام نفس النوع من مرشح الحقنة المستخدم في BSA. بعد تصفية وسائط الاستزراع ، قم بتحميل 300 ميكرولتر من وسط الثقافة في كل بئر من لوحة ثقافة 24 بئر. بعد ذلك ، ضع وسط زراعة الخلايا 24 لوحة بئر ووسائط التشريح في حاضنة لمدة ساعة واحدة على الأقل لتحقيق التوازن.

بعد ذلك ، اغمر معدات تشريح الأوتوكلاف في 70٪ من الإيثانول. احصل على أجنة E15 البرية من النوع البري C57 الأسود 6J كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب وضعها في طبق بتري يحتوي على وسط تشريح. بعد قطع الرأس ، اغسل الجلد بنسبة 70٪ من الإيثانول واستخدم مقص Vannas الصغير لإزالة الأطراف الخلفية من الأجنة عن طريق شق حول عظم الفخذ القريب.

هذا يضمن إزالة أكبر قدر ممكن من الطرف الخلفي. ضع الأطراف الخلفية في طبق بتري واغمرها في وسط التشريح قبل تشريح مشط القدم. ثم ضعهم تحت مجهر تشريح.

استخدم ملاقط رقم أربعة لتثبيت الطرف أثناء استخدام ملاقط رقم خمسة لإزالة الجلد المحيط بالقدم الجنينية. يتم تنفيذ ذلك بشكل أكثر فاعلية عن طريق الإمساك بالجلد على مستوى الساق تقريبا والسحب نحو الكتائب. بعد ذلك ، استخدم الملقط رقم أربعة لإمساك رصغي القدم الجنينية بعناية أثناء استخدام الملقط رقم خمسة لإزالة مشط القدم الأول والخامس والتخلص منه.

مع تثبيت القدم في نفس الوضع ، استخدم الملقط رقم خمسة لتعطيل الأنسجة الضامة بين الكتائب الثلاثة المتبقية ومشط القدم. بعد ذلك ، أدخل طرف الملقط رقم خمسة عند المفصل بين الكتائب ومشط القدم لإزالة الكتائب من مشط القدم. أخيرا ، استخدم الملقط رقم خمسة لتعطيل الأنسجة الضامة بين الرصغيين والمشط.

مرة أخرى ، ضع طرف الملقط رقم خمسة في مساحة المفصل بين الرصغيين والمشط وحرر مشط القدم برفق من الرصغ. بعد ذلك ، التقط مشط القدم المجاني الآن برفق باستخدام الملقط رقم أربعة وضعه في وسط تشريح جديد. من الأهمية بمكان ألا تتلف مشط القدم الجنيني أو لا تجف أثناء خطوات التشريح والتعامل.

يؤثر تلف مشط القدم على نموها وتمعدنها. ستنفصل أي أنسجة رخوة متبقية عن مشط القدم أثناء المزرعة ، لذلك لا تهتم كثيرا بإزالتها الكاملة أثناء التشريح. عندما يتم تشريح جميع مشط القدم المطلوبة ، ضع مشط القدم بعناية بشكل فردي في صفيحة 24 بئر مسخنة مسبقا تحتوي على 300 ميكرولتر من وسط الاستزراع.

بعد ذلك ، قم بإجراء قياسات طولية أولية باستخدام مجهر مزود بكاميرا رقمية مرفقة وبرنامج تحليل الصور. استزراع مشط القدم لمدة تصل إلى 14 يوما. ومع ذلك ، لا تغير وسائط مزارع E15 حتى اليوم الخامس على الأقل من الاستزراع لأن هذا يؤثر على قدرتها على التمعدن.

بعد بضعة أيام في الثقافة ، قم بقياس طول منطقة التمعدن المركزية عند ظهورها. بعد بضعة أيام في الثقافة ، يحدث تمعدن المصفوفة في منتصف الحجاب الحاجز للعظام الأولية ويمكن ملاحظته بسهولة عن طريق الفحص المجهري الضوئي. غالبا ما يتم تجميع مشط القدم الثاني والثالث والرابع للدراسات الجنينية.

خلال سبعة أيام من الاستزراع ، لم تكشف مشط القدم الثاني والثالث والرابع عن أي اختلافات ذات دلالة إحصائية في مظهر أو مدى التمعدن ، مما يؤكد صحة هذه الممارسة. لفحص تأثيرات ركائز التمعدن المختلفة وناهضات على قدرة تمعدن مشط القدم ، تم استزراع مشط القدم E15 في وسائط تحتوي على مجموعة من المكملات كما هو موضح هنا. تم تسجيل الصور وقياسات الطول يوميا.

من بين جميع الركائز التي تم اختبارها ، زاد حمض الأسكوربيك من طول المعدن بشكل أكبر وأكثر قابلية للمقارنة مع تأثيرات بيتا جلسرول فوسفات. أدى تعداء الفيروس العدسي لبلازميد GFP إلى مشط القدم E15 إلى التعبير عن GFP في جميع أنحاء مشط القدم. هذا يسلط الضوء على استخدام فيروس العدسات لنقل مشط القدم الجنيني بنجاح.

يمكن أيضا استخدام هذه التقنية لإسقاط الجينات المستهدفة أو الإفراط في التعبير عنها. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن مشط القدم E15 هش للغاية. تعتبر سلامة مشط القدم أمرا بالغ الأهمية لنجاح ثقافة المصب.

بعد تشريح واستزراع مشط القدم E15 ، يمكن إجراء العديد من التحليلات النهائية. على سبيل المثال ، يمكن تقييم تعبير mRNA والبروتين عن طريق RTQPCR و Western Blotting ، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الكيمياء المناعية لتوطين البروتينات داخل مشط القدم.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تشريح مشط القدم بنجاح من الأطراف الخلفية لفئران اليوم الجنيني 15. يمكن تكييف هذه الطريقة مع مشط القدم الجنيني 17 أو 18 ، والتي تعتبر أكثر فائدة لدراسة نمو العظام.