عالية الدقة قياس التنفس لتقييم وظيفة الميتوكوندريا في Permeabilized وخلايا سليمة

يستخدم عالية الدقة قياس التنفس لتحديد استهلاك الأوكسجين الميتوكوندريا. هذا هو أسلوب واضحة لتحديد المجمعات السلسلة التنفسية الميتوكوندريا "(I-IV) وتيرة التنفس، أقصى قدرة الميتوكوندريا نظام نقل الإلكترون، والميتوكوندريا سلامة الغشاء الخارجي.

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام قياس ريسيرومتر عالي الدقة لتحديد استهلاك الأكسجين في الميتوكوندريا. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المتلازمات والأمراض المرتبطة بخلل الميتوكوندريا مثل ؛ الإنتان والأمراض العصبية المتنوعة والاضطرابات المرتبطة بالعمر. تتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها تتمتع بحساسية أعلى والقدرة على إجراء الركيزة في تجارب المعايرة بالتحليل الحجمي المثبطة المقترنة مع عدد صغير من العينات البيولوجية مثل الخلايا السليمة أو المنفذة.

ستظهر الإجراء ساندرا ناسوز ، فنية من مختبري. قبل البدء في الإجراء ، يقوم الهواء بمعايرة مستشعرات الأكسجين البولاروغرافي ثم إعادة تعليق الخلايا في مخزن التنفس إلى واحد في عشرة إلى الخلايا السادسة لكل تركيز مليلتر واستبدال وسط التنفس في غرفة واحدة من الأوكسجرافية ب 2.1 مل من تعليق الخلية. أغلق الغرفة بالسدادة واضبط شريط التحريك المغناطيسي في الغرفة على 700 دورة في الدقيقة.

ثم سجل التنفس الخلوي لمدة 5 إلى 10 دقائق حتى يتم تحقيق إشارة تدفق الأكسجين المستقرة. بعد ذلك ، استخدم حقنة لحقن ميكرولترين من Rotenone من خلال منفذ حقن التيتانيوم في غرفة الأوكسجين وتسجيل التنفس الخلوي لمدة 5 إلى 10 دقائق أخرى. عند تحقيق إشارة تدفق الأكسجين المستقرة ، قم بحقن 20 ميكرولترا من سكسينات مولية واحدة متبوعة ب 10 ميكرولتر من 0.5 مولار ADP.

ثم حقن مجلدين من ميكرولترين من اثنين من المليمولار ديجيتونين وسجل التنفس الخلوي لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق بعد كل حقنة متبوعا بالحقن التدريجي من اثنين إلى أربعة ميكرولتر من اثنين من المليمولار ديجيتونين حتى تصل إشارة تدفق الأكسجين إلى الحد الأقصى ولا تؤدي حقن الديجيتونين الإضافية إلى زيادة معدل التنفس. لتقييم سلامة الغشاء الخارجي للميتوكوندريا ، قم بإعداد غرفة أوكسجراف، كما هو موضح للتو، وقم بحقن ميكرولترين من ثمانية ملليمولار ديجيتونين لاختراق الخلايا. بعد خمس دقائق ، قم بحقن 20 ميكرولترا من سكسينات مولر واحد وسجل التنفس الخلوي لمدة 5 إلى 10 دقائق حتى يتم تحقيق إشارة تدفق الأكسجين المستقرة.

ثم حقن 10 ميكرولتر من 0.5 مولار ADP لتحفيز المركب الثاني ، وللحث على زيادة استهلاك الأكسجين. عندما يتم تحقيق إشارة تدفق مستقرة ، قم بحقن خمسة ميكرولترات من أربعة ملليمولار السيتوكروم ج متبوعا بميكرولتر واحد من أربعة ملليغرام لكل مليلتر من الليغامايسين. لقياس التنفس المحفز ب ADP لخلايا سرطان خلايا الكبد الكبدية ، قم بإعداد غرفة المحار كما هو موضح للتو ، وحقن ميكرولترين من ثمانية مللي مولار ديجيتونين في غرفة الأكسجين لاختراق الخلايا لمدة خمس دقائق ، متبوعا بحقن 12.5 ميكرولتر من 0.8 مولار و 10 ميكرولتر من اثنين من الغلوتامات المولارية.

عندما يتم تحقيق تدفق أكسجين مستقر ، قم بحقن 10 ميكرولتر من 0.5 مولار ADP لزيادة استهلاك الأكسجين ، متبوعا بميكرولترين من 0.2 مللي مولار روتينون و 20 ميكرولتر من سكسينات مولار واحد. بعد ذلك ، قم بحقن ميكرولترين من خمسة ملليمولار أنتيمايسين وسجل التنفس الخلوي. عندما تنخفض الإشارة وتستقر ، قم بحقن 2.5 ميكرولتر من 0.8 مللي مولار متبوعا بالحقن الفوري ل 2.5 ميكرولتر من 0.2 ملليمولار TMPD ، وتسجيل التنفس الخلوي حتى تزداد إشارة تدفق الأكسجين وتستقر.

ثم قم بحقن 10 ميكرولترات من أزيت الصوديوم المولي في غرفة الأوكسجين ، وسجل الشفط الخلوي حتى تنخفض إشارة تدفق الأكسجين وتستقر. لقياس استهلاك الأكسجين الخلوي السليم ، قم بإعداد غرفة أوكسجين كما هو موضح للتو وحقن 1 ميكرولتر من أربعة ملليغرام لكل مليلتر أليجيميسين متبوعا بحقن واحد وثلاثة ميكرولتر من 0.2 ملليمولار FCCP. بعد ذلك ، قم بمعايرة FCCP في خطوات 0.1 إلى 0.3 ميكرومولار عن طريق حقن واحد إلى ثلاثة ميكرولتر من 0.2 إلى ملليمولار FCCP حتى تصل إشارة تدفق الأكسجين إلى مستواها الأقصى دون زيادات أخرى ، ثم تبدأ في الانخفاض.

بعد ذلك ، قم بحقن ميكرولترين من 0.2 ملليمولار روتينون وميكرولترين من خمسة ملليمولار أنتيمايسين أ وسجل التنفس حتى تنخفض إشارة تدفق الأكسجين وتستقر. في حالة عدم وجود الديجيتونين ، يكون التنفس الخلوي منخفضا جدا ، ولا يتم تحفيز تنفس الخلايا السليمة غير المنفذة في وجود ركيزة الميتوكوندريا و ADP. ومع ذلك ، عند الإضافة التدريجية للديجيتونين ، يصبح غشاء البلازما الخلوي منفذا ويزداد تنفس الميتوكوندريا حتى النفاذية الكاملة ، وفي ذلك الوقت يدخل السكسينات و ADP إلى الخلايا.

ومع ذلك ، يمكن أن تتأثر سلامة الغشاء الخارجي للميتوكوندريا ، إذا تم استخدام كميات زائدة من الديجيتونين ، مما يؤدي إلى انخفاض في التنفس المعقد إلى الحالة المعتمدة ثلاثة. لا يعزز السيتوكروم ج تنفس المعقد إلى الحالة المعتمدة في الخلايا المعالجة بالديجيتونين ، مما يشير إلى عدم وجود فقدان للسيتوكروم ج من الغشاء الخارجي للميتوكوندريا ، وأن سلامة الميتوكوندريا محفوظة ، على الرغم من أن السيتوكروم ج يمكن أن يعزز تنفس الخلايا المعالجة بجرعات عالية جدا من الديجيتونين. تؤدي إضافة ركائز خارجية لنشاط الميتوكوندريا المعقد بعد نفاذية الديجيتونين إلى زيادة في مجمعات سلسلة الجهاز التنفسي للميتوكوندريا واحد واثنين وأربعة معدلات تنفس قصوى.

قد يكون توليد مستويات الجهاز التنفسي المنخفضة ناتجا عن تلوث غرف الأوكسجراف، بمثبطات الميتوكوندريا من التجربة السابقة. في وجود الليجيمايسين والإضافة المتسلسلة ل FCCP ، لوحظ الحد الأقصى لمعدل التنفس غير المقترن للخلايا. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بأي من هذه التقنيات في أقل من ساعة واحدة إذا تم تنفيذها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم جدا تذكر غسل غرف الأوكسجراف والسدادات على نطاق واسع بعد كل تجربة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل قياسات محتوى ATP الخلوي ، كل منها في نشاط موسمي ، ويمكن إجراء مستويات ركيزة الميتوكوندريا من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل ما إذا كانت التغييرات في معدلات التنفس ناتجة عن نقص ركائز الميتوكوندريا أو انخفاض نشاط ATP cyntates. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الثنائيات لاستكشاف وظيفة الميتوكوندريا في مجالات مثل أمراض الميتوكوندريا المكتسبة والوراثية ، والإجهاد المؤكسد ، وإصابة نضح الجلد والشيخوخة في الخلايا أو الألياف السليمة أو المنفذة والميتوكوندريا المعزولة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية مساعدة وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا المنفذة والسليمة باستخدام قياس إعادة التسخين عالي الدقة. لا تنس أن العمل مع antimycin a و rotenone و sodium iozide و FCCP و aricomycin يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات ومعاطف المختبر أثناء تنفيذ هذا الإجراء.