باستخدام الأشعة السينية البلورات، الفيزياء الحيوية، وفحوصات وظيفية لتحديد آليات الحكم تي خلية مستقبلات الاعتراف السرطان المستضدات

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد مستقبلات الخلايا التائية الراكدة القابلة للذوبان وبروتينات HLA الببتيد ذات الجودة الكافية لاستخدامها في التحليل الفيزيائي الحيوي والهيكلي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة في مجال مناعة الخلايا التائية. على سبيل المثال ، لماذا لا تستجيب الخلايا التائية بقوة للسرطان؟

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا نحصل على بيانات ميكانيكية عالية الدقة تشرح كيف تتعرف مستقبلات الخلايا التائية على أهدافها ، مما يؤدي إلى استجابات مناعية بوساطة الخلايا التائية. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو علاج أو تشخيص أي مرض بشري تقريبا لأن الخلايا التائية تلعب دورا محوريا في معظم الاستجابات المناعية. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للاستجابات المناعية للخلايا التائية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الأنظمة الأخرى التي يتم التحكم فيها عن طريق تفاعلات ترابط المستقبلات.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنه من الصعب جدا إنتاج بروتينات نشطة قابلة للذوبان ذات جودة كافية للتجارب الفيزيائية الحيوية والهيكلية. لبدء إجراء إعادة طي الببتيد HLA إلى ستة ملليلتر من المخزن المؤقت للجوانيدين مع 10 ميلومتر ثنائي ثيوثريتول ، أضف 30 ملليغرام من أجسام التضمين HLA-A2 ، و 30 ملليغرام من أجسام تضمين بيتا 2-M وأربعة ملليغرامات من الببتيد المطلوب ذي الأهمية. احتضن الخليط لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

بعد ذلك ، قم بتخفيف الخليط بلتر واحد من محلول HLA ، المبرد مسبقا إلى أربع درجات مئوية وحرك الخليط لمدة ثلاث ساعات عند درجة الحرارة هذه. غسيل الخليط مرتين مقابل 20 لترا من 10 مللي مولار تريس ، درجة الحموضة 8.1 ، لمدة 24 ساعة لكل منهما. لبدء إجراء إعادة طي TCR ، إلى ستة ملليلتر من المخزن المؤقت guanidine مع 10 ملليمولار dithiothreitol ، أضف 30 ملليغرام لكل من TCR Alpha و beta سلسلة IB.

احتضن الخليط لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية وخفف الخليط في لتر واحد من المخزن المؤقت TCR المبرد مسبقا. حرك خليط إعادة تدوير TCR المخفف وقم بغسيل الكلى بنفس طريقة خليط الببتيد HLA. قم بتصفية كل من مخاليط المقاومة للغسيل من خلال مرشح غشاء 0.45 ميكرومتر.

بعد ذلك ، قم بتحميل أحد مستحضرات المقاومة للترشيح على عمود راتنج تبادل الأنيون سعة 7.9 مليلتر 50 ميكرومتر ، متوازن مسبقا مع 20 مل من 10 ملليمولار تريس ، درجة الحموضة 8.1. قم بإزالة البروتين بنظام عازلة متدرج الملح بمعدل خمسة ملليلتر في الدقيقة. اجمع كسور مليلتر واحدة وحلل الكسور باستخدام SDS-Page.

امزج الكسور التي تحتوي على البروتين المعاد طيه. ضع خليط البروتين في مكثف طرد مركزي بوزن جزيئي 10 كيلودالتون. الطرد المركزي الخليط لمدة 20 دقيقة أو مهما كانت المدة مطلوبة ، عند 4000 مرة جم ، لتركيز الخليط إلى 500 ميكرولتر.

تجاهل التدفق من خلال. قم بتشكيل مستحضر البروتين المركز في حلقة حقن ملليلتر وحقن البروتين على عمود كروماتوغرافيا استبعاد بحجم 24 مليلتر ، متوازنا مسبقا مع المخزن المؤقت المناسب للمراوغة. قم بتخفيض البروتين بحجم عمود واحد من المخزن المؤقت بمعدل 0.5 مل في الدقيقة.

اجمع كسور مليلتر واحدة ، وحلل الكسور باستخدام SDS-Page واجمع الكسور التي تحتوي على البروتين محل الاهتمام. قم بإعداد 10 تخفيفات تسلسلية لمحلول TCR ، في نطاق تركيز يمتد 10 مرات فوق إلى 10 مرات أقل من KD لتفاعل HLA المحدد لببتيد TCR إذا كان معروفا. خلاف ذلك ، ابدأ من تركيز TCR البالغ 200 ميكرومولار.

بعد ذلك ، قم بتنشيط شريحة مستشعر مطلية بالكربوكسي ميثيل ديكستران عن طريق تدفق خليط واحد إلى واحد من 100 مللي مولار و N-Hydroxysuccinimide و 400 مللي مولار EDC فوق الرقاقة بمعدل تدفق 10 ميكرولتر في الدقيقة لمدة 10 دقائق ، عند 25 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بتحميل 110 ميكرولتر من 200 ميكروغرام لكل مليلتر من الستربتافيدين و 10 ملليمولار أسيتات الأس الهيدروجيني 4.5 في جميع خلايا التدفق الأربع لتشغيل سطح الشريحة. قم بإلغاء تنشيط أي مجموعات تفاعلية متبقية تحتوي على 100 ميكرولتر من هيدروكلوريد إيثانول أميد مولي.

بعد ذلك ، قم بتدفق محلول من ببتيد ميكرومولار واحد تقريبا HLA في المخزن المؤقت الذي توفره الشركة المصنعة للرقاقة على سطح الرقاقة بمعدل 10 ميكرولتر في الدقيقة حتى يزداد عدد وحدات الاستجابة بمقدار 500 إلى 600. قم بتشبع سطح الرقاقة بميكروتين واحد مللي مولار ومخزن مؤقت مقدم من المصنع لمدة 60 ثانية. بعد ذلك ، قم بحقن 10 تخفيفات تسلسلية لمحلول TCR بمعدل 30 ميكرولتر في الدقيقة عند 25 درجة مئوية.

احسب ثابت ربط التوازن وقم بإجراء تحليل الحركية. قم بإجراء سلسلة من تجارب SPR بهذه الطريقة ، مع تغيير درجة الحرارة التي يتم عندها حقن تخفيفات TCR. حدد ثابت ربط التوازن لكل درجة حرارة واحسب طاقات جيبس والمعلمات الديناميكية الحرارية الأخرى.

قم بتوصيل طاقات جيبس ضد درجة الحرارة باستخدام ملاءمة انحدار غير خطية. تركيز محلول الببتيد HLA إلى 0.2 مللي مولار ومخزن مؤقت للبلورة عن طريق الطرد المركزي عند 3 ، 000 مرة جم ، في مكثف طرد مركزي بوزن جزيئي 10 كيلودالتون. قم بإعداد محلول 0.1 مللي مولار من واحد إلى واحد TCR والببتيد HLA للتبلور المركب المشترك.

باستخدام روبوت التبلور ومجموعة الغربلة ، قم بإعداد تجارب التبلور باستخدام تقنية قطرة الجلوس في لوحة 96 بئرا. مع 60 ميكرولتر من مخزن التبلور في كل خزان ، وتتكون كل قطرة من 200 نانولتر لكل من محلول البروتين والمخزن المؤقت. تنمو البلورات عند 18 درجة مئوية.

سجل البلورات تحت المجهر بعد 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة ثم أسبوعيا. بمجرد نمو بلورات مفردة ذات جودة كافية ، قم بحصاد البلورات المفردة بحلقة متوافقة مع التبريد وقم بتخزين البلورات في النيتروجين السائل. قم بإجراء حيود الأشعة السينية السنكروترون تحت تيار من غاز النيتروجين عند 100 كلفن ، وتحليل البيانات وحل الهياكل باستخدام البرنامج المناسب.

احسب جهات الاتصال وتكامل السطح وزاوية العبور من الهياكل التي تم حلها. باستخدام هذه الطرق ، تم التعبير عن جزيئات TCR والببتيد HLA وإعادة طيها في شكل قابل للذوبان. كان الببتيد الموجود في جزيئات الببتيد HLA هو مستضد gp100.

تم استخدام SPR لتحديد تقارب ربط PMEL17 TCR للمستضد في درجات حرارة مختلفة. ثم تم استخدام كل من SPR والمعايرة بالسعرات الحرارية متساوية الحرارة ، لتحديد المعلمات الديناميكية الحرارية للتفاعل بين البروتين والبروتين. تم تبلور مركب PMEL17 TCR A2-YLE-9V وتقييمه باستخدام حيود الأشعة السينية السنكروترون.

تم تحديد حلقات TCR CDR وبقايا HLA الببتيد التي يلامسها بروتين TCR وتمت دراسة طبيعة جهات الاتصال. كما تم تنقية جزيئات الببتيد HLA ذات الأشكال المتحولة من الببتيد وتبلورها بهذه الطريقة. التحقيق في الاختلافات الهيكلية التي يمكن أن تمنع تفاعلات الربط مع TCR.

تم العثور على طفرة في البقايا الثالثة أو الخامسة لتغيير موضع البرولين الرابع بشكل كبير ، مما قد يعطل العديد من الاتصالات مع TCR CDR-3 Alpha Loop. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم اختيار أنقى البروتينات فقط لمزيد من التحليل. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تلطيخ ربعي الببتيد HLA باستخدام البروتينات القابلة للذوبان من أجل عزل الخلايا التائية الخاصة بالمستضد من دم المريض للتشخيص ومزيد من التحليل.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال مناعة الخلايا التائية لاستكشاف ارتباط ببتيد TCR HLA بتفاصيل رائعة ، مما مكن من تطوير أدوية جديدة للسرطان والأمراض البشرية الأخرى. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد بروتينات TCR والببتيد HLA ذات الجودة الكافية لإجراء التحليل الفيزيائي الحيوي والهيكلي.