إنتاج النسخ المعيبة للفيروسات الارتدادية التي ترنسفكأيشن عابر للخلايا 293T

نحن هنا في معهد أبحاث الأورام الجزيئية في مركز تافتس نيو إنجلاند الطبي. اسمي كريستينا ليسكو، وأنا زميلة ما بعد الدكتوراه في مختبر الدكتور ريك فان. يعمل مختبرنا على دراسة ابيضاض الدم النقوي المزمن لدى البشر، CML والأمراض الشبيهة بـ CML.

نحن نقوم بنمذجة هذا المرض البشري في الفئران، والطريقة التي نتبعها هي إدخال الجين الورمي البشري عبر ناقل ريتروفيروسي. لذا، فإن الخطوة الأولى لإدخال هذا الجين الورمي البشري في خلايا الفئران هي تصنيع الفيروس نفسه. أما الخطوة التالية فستكون هي معايرة الفيروس فعلياً.

هذا هو طبق الخلايا الأصلية من نوع 2 9 3 T. سأقوم بغسل الوسط باستخدام PBS. وتعد خلايا 2 9 3 T من الخلايا الملتصقة، ومع ذلك، فإن درجة التصاقها ليست عالية جداً، لذا يجب أن تكون كل حركة رقيقة للغاية. وبمجرد الانتهاء من الغسل، سنقوم باستبدال PBS بـ trypsin.

من أجل فصل الخلايا عن الطبق، نحتاج إلى إعادة وضع الطبق في الحاضنة لمدة ثلاث دقائق تقريباً. لذا، بعد مرور دقيقتين أو ثلاث، ستصبح الخلايا في حالة تعليق. سنقوم بإضافة بضعة ملليلترات إضافية من الوسط الغذائي العادي.

سيعمل هذا على تحييد التريبسين. في هذه المرحلة، نقوم بالرج للأعلى والأسفل للتأكد من أن جميع الخلايا معلقة بشكل جيد، ثم ننقل المعلق إلى أنبوب سعة 50 ml ولعد الخلايا بوجود صبغة تريبان بلو واستخدام مقياس كرات الدم (Hemocytometer) لعدها يدويًا. لذا أقوم الآن بإجراء التخفيف وفقًا للحسابات، وسأقوم الآن بزراعة 3 × 10⁶ خلية لكل طبق.

في 4 ml من الوسط الغذائي، نتأكد من توزيع الخلايا بشكل جيد في الأطباق، ثم سنعيد الأطباق إلى الحاضنة لمدة تتراوح بين 16 إلى 18 ساعة، وهو ما يكون عادةً في صباح اليوم التالي. وبذلك نكون الآن بعد مرور 48 ساعة على الإصابة بفيروس GFP. ويُستخدم الكلوروكين من أجل زيادة امتصاص الحمض النووي DNA الذي سنضيفه إلى الخلايا.

قمنا بسحب الوسط الغذائي برفق بعيداً عن الخلايا، والتي التصقت الآن بالبقع الجانبية للأطباق. في هذه المرحلة، سنعيد الأطباق إلى الحاضنات لمدة ساعة تقريباً. وفي هذه الأثناء، سنقوم بتحضير خليط DNA لتطبيقه على الخلايا؛ حيث يعبر البعض عن جين مقاوم للنيوميسين، بينما يعبر البعض الآخر عن GFP. أنا أستخدم XI DNA للتحكم في عملية عفن التحول (transfection) بأكملها.

أخيراً، نقوم بإضافة كلوريد الكالسيوم. حيث يؤدي استخدام كلوريد الكالسيوم إلى زيادة كفاءة عفن التحول (transfection) بشكل كبير. لقد مضت الآن ساعة واحدة، وقد أخذنا الأطباق التي تحتوي على وسط الكلوروكين، وسنقوم الآن بإضافة محلول عفن التحول.

الخطوة الأخيرة التي يتعين علينا القيام بها هي إضافة 1 ml من محلول HBS المعقم بتركيز 2x، وأثناء إضافة محلول H2XHBS، يجب علينا رج الأنبوب باستخدام جهاز vortex في الوقت ذاته، مع الإضافة ببطء قطرة بقطرة؛ وذلك لتجنب حدوث ترسيبات. بعد ذلك، يتم توزيع 1 ml من المحلول فوراً على الطبق المطلوب، مع تكرار عملية الإضافة قطرة بقطرة.

في هذه المرحلة، تكون خلايا 2 9 3 T حساسة للغاية، وذلك بسبب وسط الكلوروكين المستخدم. يجب التأكد من تغطية المنطقة بالكامل وتقليل تحريك الأطباق قدر الإمكان، ثم قم بتمييز الطبق باسم التركيب الجيني الذي وضعته، وكرر العملية مع التركيب التالي.

في هذه المرحلة، ضع الأطباق في الحاضنة لمدة تتراوح من سبع إلى 11 ساعة. يجب ألا تقل المدة عن سبع ساعات وألا تزيد عن 11 ساعة؛ لأن الخلايا تكون حساسة للغاية بسبب الكلوروكين، وسنحتاج إلى تغيير الوسط بعد هذه المدة. لقد مضى الآن حوالي 30 ساعة على عملية عفن النقل (transfection).

هذا هو التغيير الأخير للوسط في هذه المرحلة، حيث وصلت خلايا 2 9 3 C3 T إلى مرحلة الالتحام. يجب علينا، مرة أخرى، أن نكون حذرين للغاية عند إضافة الوسط الجديد على جانب الطبق. أنا أستخدم سرنجة سعة 10 ml مع إبرة.

سأقوم باستبدال الإبرة بمرشح، لذا سأقوم بخلط الوسط جيداً في هذه المرحلة. لقد جمعنا الفيروس الخاص بنا ويمكننا وضعه في درجة حرارة -80 °C حتى يحين موعد استخدامه. أول شيء يجب القيام به هو تكثيف الفيروس فعلياً. هناك عدة خطوات حساسة أثناء تحضير الفيروس، وأولها هي الوصول إلى التركيز الصحيح لخلايا 2 9 3 T.

نقوم بزراعتها بكثافة 10⁶ خلية لكل طبق، لأنها ستصل إلى حالة تلاقي بنسبة 80% تقريباً بعد 18 ساعة. وهذا يمنح الخلايا وقتاً إضافياً للنمو، وبذلك ستكون متلاقية بنسبة 100% بعد 24 ساعة من عملية عفن التعداء (transfection). وقد ثبت أن هذا الأمر بالغ الأهمية للحصول على عيار فيروسي ممتاز.

تتمثل الخطوة التالية في استخدام الكلوروكين، حيث يعمل استخدامه في الواقع على تحسيس خلايا 2 9 3، ويجب إجراء جميع عمليات تغيير الوسط بدقة وببطء شديد لضمان عدم انفصال طبقة خلايا 2 9 3 T بأكملها عن الطبق. وأخيراً، يجب أن يكون الحمض النووي DNA المستخدم في إنتاج الفيروس نقياً للغاية؛ ونحن نستخدم DNA من نطاق C.

بمجرد الحصول على الفيروس، نقوم بحفظه في درجة حرارة -80 °C. وعادةً ما نقوم بمتابعته لمرة واحدة، حيث سيقل عيار الفيروس بمقدار ضعفين. لذلك، نفضل تجميد الفيروس الذي قمنا بتحضيره مسبقاً قبل إجراء عملية تحديد العيار الفعلي للفيروس.

اعتماداً على الفيروسات المستخدمة، قد يتوفر لدينا تعبير عن GFP مع الفيروس لتتبع الخلايا المصابة فعلياً، أو يمكن أن تكون مقاومة للنيوميسين. ومن المهم جداً تحديد عيار الفيروس فعلياً قبل استخدامه لضمان القدرة على إجراء مطابقة بين التجارب أو بين الطفرات المختلفة.