إعداد ذبابة الفاكهة والتصوير الطولي من وظيفة القلب في فيفو باستخدام البصرية بالاتساق المجهري (OCM)

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصوير وظيفة قلب ذبابة الفاكهة طوليا في الجسم الحي باستخدام تقنية الفحص المجهري للتماسك البصري. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال ذبابة الفاكهة التطور الهيكلي والوظيفي للقلب من خلال توفير مقاييس ، مثل التغيرات في قطر القلب ومعدل ضربات القلب وفترة نشاط القلب أثناء ذبابة الفاكهة التحول. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الفحص المجهري للتماسك البصري قادر على تصوير قلوب الصغيرة بشكل غير جراحي بدقة مكانية وزمانية عالية.

قد تساعد هذه التقنية في الكشف عن آليات أمراض القلب البشرية والعلاقة بنمو القلب بسبب أوجه التشابه الجيني الموجودة بين ذبابة الفاكهة والفقاريات. يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على أنظمة أخرى ، مثل الإيقاع البصري الوراثي لدراسة أو علاج وظيفة جهاز تنظيم ضربات القلب الضعيفة في النماذج الحيوانية. عند إنتاج الذباب لهذه التجربة ، اسمح للذباب الأبوي التناسلي بالتزاوج ووضع البيض في قارورة طازجة لمدة ثماني ساعات.

وبالتالي ، فإن مخلب البيض الموضوع سوف يتطور إلى ذباب من نفس العمر. لتركيب يرقة لتصوير OCM ، قم أولا بإعداد جانب نظيف بقطعة من الشريط على الوجهين. ادفع أي فقاعات هواء محاصرة أسفل الشريط.

بعد ذلك ، استخدم فرشاة ناعمة لإزالة يرقة بالحجم المناسب من القارورة. ضع اليرقة على منديل نظيف. قم بإزالة أي طعام عالق به باستخدام فرشاة مبللة ثم اتركه يجف.

الآن ، تحت مجهر ميداني واسع ، تأكد من مرحلة تطور اليرقة. ثم ضع اليرقة بحيث يكون الجانب الظهري متجها لأعلى للتركيب. بعد ذلك ، قم بخفض الشريحة اللاصقة على اليرقة واستخدم ضغطا معتدلا لتثبيتها على الشريط.

ضع اليرقة المثبتة على المرحلة القابلة للتعديل لنظام OCM على طول الاتجاه العرضي y بحيث يكون الجانب الظهري متجها لأعلى. ثقب صغير في المرحلة يبقي اليرقة بعيدا عن ملامسة مستوى المسرح. تم العثور على تجويف واسع لأنبوب القلب من الأجزاء A5 إلى A8. باستخدام الصور في الوقت الفعلي على الكمبيوتر ، ابحث عن المنطقة الخلفية لأنبوب القلب وحرك المرحلة للأمام حتى يصبح الجزء A7 مرئيا.

الآن ، قم بتعيين معلمات الحصول على الصورة. استخدم 100 مسح صوتي لكل فحص B واستخدم 100 مسح ضوئي B. بعد ذلك ، اضبط جهد الماسح الضوئي لتغطية حوالي 0.28 ملم في الاتجاه العرضي x واضبطه على 0 فولت في الاتجاه العرضي y.

بعد ذلك ، قم بحظر مسار شعاع العينة بقطعة قماش داكنة وانقر فوق زر البدء في البرنامج للحصول على بيانات ضوضاء الخلفية لطرح الخلفية. لجمع صور عرضية في الوضع M، اضبط المعلمات على 128 مسحا ضوئيا لكل مسح B واستخدم 4،096 مسحا ضوئيا B. بعد ذلك ، أعد ضبط الجهد لتغطية 0.28 ملم في الاتجاه x و 0 فولت في اتجاه y كما كان من قبل.

بعد ذلك ، احصل على صور في الوضع M المستعرض للجزء A7 من أنبوب قلب الذبابة. أثناء عملية توفير البيانات ، قم بحجب شعاع التصوير بقطعة قماش داكنة لتقليل التعرض للضوء لعينة العينة. صور القلب خمس مرات للحصول على قياس موثوق لوظائف القلب.

لجمع صور ثلاثية الأبعاد، استخدم 400 مسح A لكل مسح B، و 800 مسح ضوئي B، واستخدم الجهد الكهربائي ل 1.7 ملليمتر على العرضي x وحوالي 4 ملليمترات على العرضية y. بعد ذلك ، حرك مرحلة المجهر لمراقبة الذبابة بأكملها واضبط التركيز لرؤية صور واضحة. لإزالة اليرقة ، استخدم فرشاة مبللة وناعمة لنقلها إلى قارورة جديدة بها طعام طازج لمواصلة التطوير والدراسة الطولية.

يظل التجويف العريض لأنبوب القلب عند الأجزاء A5 إلى A8 في مرحلة العذراء PD1. في PD1 ، حاول تصوير الجزء A7 ، كما هو الحال مع يرقة المرحلة L2 و L3. يتم تحديد مرحلة العذراء PD1 بواسطة الشرانق الأبيض.

هذه النافذة الزمنية مثالية لإجراء التصوير البصري للخادرة المبكرة لأن الشفافية العالية تؤدي إلى اختراق أعلى للضوء لتصوير OCM. نظف الخادرة بالفرشاة إذا كان هناك طعام عالق بالجسم. باستخدام فرشاة مبللة ، قم بتركيب الخادرة على شريحة زجاجية صغيرة وحافظ على الجانب الظهري متجها لأعلى.

يجب أن تتناسب الشريحة مع أنبوب ذبابة للحفاظ على نمو في غرفته الخاصة. جفف أي ماء زائد من الخادرة ثم ضعه على المسرح بحيث تكون الخادرة متجهة لأعلى واستمر في تصوير الجزء A7 كما هو الحال مع اليرقة. بعد التصوير ، انقل الشريحة الزجاجية مع الخادرة إلى الأنبوب للثقافة المستمرة.

بعد مرحلة PD1 ، بدءا من PD2 ، تبدأ غرفة مخروطية الشكل في التطور بين الأجزاء A1 و A4. نظرا لأن الخادرة تصبح أكثر غموضا بشكل تدريجي ، يتم تقليل عمق اختراق نظام التصوير. في PD2 ، تصبح قشرة الخادرة صفراء ويكون الجسم أقل شفافية من PD1.

في PD3 ، لا يزال لون الخادرة أغمق قليلا من لون مرحلة PD2. بحلول مرحلة PD4 ، يمكن ملاحظة خطوط سوداء داخل القشرة. سيتطور بعض PD4 إلى بالغين والبعض الآخر سيدخل مرحلة PD5.

في مرحلة PD5 ، تكون الخطوط السوداء أكثر وضوحا. التقط خادرة PD2 باستخدام الملقط وقم بتثبيتها على شريحة. في نظام OCM ، ابحث عن الطرف الأمامي لأنبوب القلب ثم تحرك حوالي 50 ميكرون نحو الجزء الخلفي للعثور على الجزء A1 من أنبوب القلب.

لاحظ أنه في مرحلة PD2 ، تكون الغرفة المخروطية للقلب صغيرة جدا وقد لا تنبض بعد. تابع التصوير كما هو موضح سابقا. كرر نفس الإجراء لتصوير ذبابة الفاكهة في مراحل PD3 و PD4 و PD5.

للبدء ، انقل الذبابة البالغة إلى قارورة فارغة يبلغ حجمها حوالي 45 ملليلترا. بعد ذلك ، اغمس قضيب قطني في محلول التخدير وضع العصا في القارورة مع طرف القطن أسفل سدادة القطن مباشرة. انتظر ثلاث دقائق.

سيتم تخدير الذبابة البالغة لمدة دقيقتين ونصف إلى ثلاث دقائق ونصف ، حسب حجمها. الآن قم بإعداد شريحة زجاجية بقطعة من الشريط على الوجهين. بعد ذلك ، باستخدام فرشاة ناعمة ، حرك الذبابة المخدرة على الشريحة الزجاجية بحيث يكون الجانب الظهري متجها لأعلى.

تحت مجهر مجال واسع ، افصل الأجنحة باستخدام الملقط وألصقها بالشريط ، وبالتالي تعريض منطقة القلب للتصوير. الآن ، استخدم تقنية التصوير الموصوفة سابقا لتصوير الجزء A1 من القلب والتضحية بالذبابة في نهاية التجربة. تم إجراء التصوير الطولي للقلب باستخدام ذباب سلالة مع نسخة واحدة من برنامج التشغيل 24B-GAL4.

في مراحل اليرقات ، يبدأ أنبوب القلب في منطقة البطن الخلفية A8 بتجويف أوسع وينتهي في الجزء الظهري الأمامي A1 بقطر أضيق. في وقت متأخر من PD2 ، بدأت غرفة مخروطية الشكل في التطور في الجزء من A1 إلى A4. تم قياس معدل ضربات قلب الذبابة من صور OCM المستعرضة في وضع M.

من الغريب أنه خلال مراحل العذراء ، توقف القلب عن النبض من حين لآخر. بشكل عام ، تباطأت ضربات القلب بشكل ملحوظ من مرحلة اليرقات إلى مرحلة العذراء ثم زادت بشكل كبير من خادرة إلى بالغة. منذ هذا التطور ، أعطت هذه التقنية الباحثين في مجال أمراض القلب التنموية أداة جديدة لاستكشاف تأثيرات الجينات المختلفة على نمو القلب في نماذج ذبابة الفاكهة.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم تتبع تطور ذبابة الفاكهة بعناية من أجل إنشاء صور في كل مرحلة من مراحل النمو.