طريقة لقياس التمثيل الغذائي في التصنيف القطعان المجتمعات خلية مجمع عن طريق مستقر النظائر للبحث عن المفقودين
فبراير 4, 2017
تصف هذه المقالة طريقة لدراسة التمثيل الغذائي الخلوي في المجتمعات المعقدة لأنواع الخلايا المتعددة ، باستخدام مزيج من تتبع النظائر المستقرة ، وفرز الخلايا لعزل أنواع معينة من الخلايا ، وقياس الطيف الكتلي.
الهدف العام من هذه الطريقة هو استخدام تتبع النظائر لقياس عملية التمثيل الغذائي للمجموعات المصنفة لمجتمعات الخلايا المعقدة. لذلك باستخدام هذه الطريقة ، يمكننا دراسة الاختلافات الأيضية بين المجموعات السكانية الفرعية لمجتمعات الخلايا المعقدة ، وكذلك التعاون الأيضي بين تلك المجموعات السكانية الفرعية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه من خلال الجمع بين تتبع النظائر وفرز الخلايا ، يمكننا الحصول على مقياس أكثر موثوقية لعملية التمثيل الغذائي ، ويمكننا أيضا التحقق من مدى موثوقية الطريقة.
يعدالعرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية ، لأنه يجمع بين التقنيات المختلفة ، وقد تؤثر طريقة التعامل مع الخلايا وطول الإجراء على عملية التمثيل الغذائي للخلايا. لاستخراج المستقلب من طبق ، أول خلايا مزرعة في صفيحة من ستة آبار في وسط ثقافة مستقرة يسمى نظائر مستقرة تحتوي على مكملات غسيل الكلى. عندما تصل الخلايا إلى 75٪ من التقاء ، اشطف الآبار مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من HBSS البارد الذي يحتوي على جلوكوز موحد.
ثم أضف 600 ميكرولتر من الميثانول المبرد مسبقا بالثلج الجاف بنسبة 100٪ إلى كل بئر ، وانقل اللوحة إلى الثلج الجاف. استخدم مكشطة خلية لفصل الخلايا ثم انقل المستخلصات بعناية من كل بئر إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة فردية. قم بتخزين الخلايا عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تحليل قياس الطيف الكتلي.
لاستخراج المستقلب للخلايا المصنفة ، قم بزراعة الخلايا في طبق 100 ملم في وسط استزراع مصنف مع مكملات غسيل الكلى ، بحيث تصل إلى التقاء 75٪ بحلول يوم الفرز. لوضع العلامات على نبض الخلايا التي تم فرزها في دورة الخلية ، قم بزراعة الخلايا في وسط غير مصنف يحتوي على مكملات غسيل الكلى حتى تصل إلى 75٪ من التقاء. بعد ذلك ، قم بتسمية الخلايا بالنبض لمدة ساعتين عن طريق استبدال الوسط بوسط ثقافة جديد مسمى.
اشطف الطبق باستخدام HBSS الدافئ الذي يحتوي على جلوكوز موحد ، وافصل الخلايا ب 1.5 مل من التربسين EDTA عند 37 درجة مئوية. بعد أربع دقائق ، قم بإلغاء تنشيط التربسين بثلاثة ملليلتر من HBSS المثلج البارد الذي يحتوي على الجلوكوز الملصق والمكملات المكالية ، وانقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر للطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في HBSS التي تحتوي على الجلوكوز المسمى والمكملات الغذائية المحللة و EDTA بمعدل واحد إلى ضعفين 10 إلى الخلايا الست لكل تركيز مليلتر ، وقم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة 40 ميكرون للحصول على تعليق خلية واحدة.
انقل الخلايا إلى أنبوب سعة خمسة ملليلتر وفرزها على مقياس التدفق الخلوي. لاستخراج المستقلب من الخلايا المصنفة الوهمية ، قم بإخراج الحطام وفرز المفردات فقط. لاستخراج المستقلب من الخلايا التي تم فرزها في دورة الخلية ، قم بإخراج الحطام والأضاعفة ، وفرز الخلايا إلى G1 و SG2M ، بناء على مضان مسبار الجيمينين.
في نهاية الفرز ، اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في 50 ميكرولتر من الماء المقطر المثلج للحصول على حبيبات متجانسة. ثم استخرج المستقلبات بسرعة عن طريق إضافة 540 ميكرولتر من الميثانول المبرد بالثلج الجاف. قم بتخزين العينة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تحليل LCMS.
يجب التخطيط جيدا لاستخراج المستقلبات من الخلايا التي تم فرزها مسبقا ، مع الانتهاء من العمل التجريبي في أسرع وقت ممكن لتقليل التغيرات الأيضية. لتحليل المستقلبات المستخرجة ، حدد أولا عددا من المستقلبات ذات المعايير المتاحة المقابلة التي تظهر قمم عينة عالية الجودة. بعد ذلك ، تحقق من جودة القمم ، مع الحرص على عدم تضمين نظائر خاطئة.
احسب نظير الكتلة من كسورنا للعينات المسماة بالنظائر بقسمة مساحة الذروة لكل نظير كتلي من الأجزاء على إجمالي مساحات الذروة لجميع نظائر الكتلة من الكسور. بعد ذلك ، احسب كسور الكربون المسماة لتخصيب الكربون 13 باستخدام صيغة تخصيب الكربون. أخيرا ، احسب كسور النيتروجين المسماة لتخصيب النيتروجين -15 باستخدام صيغة تخصيب النيتروجين.
في هذه التجربة التمثيلية ، كان هناك 66 مستقلبا تم اختياره من تحليل البيانات في الخلايا المصنفة الوهمية ، ويبدو أن 60 منها مصنفة بنظير كتلة مماثل من توزيعاتنا بين مستخلصات الأطباق والخلايا المصنفة الوهمية. على سبيل المثال ، يتشابه نظير الكتلة من توزيعنا للغلوتامات بين الطبق والمستخلصات المصنفة الوهمية ، مما يشير إلى أن نظير كتلة الغلوتامات من توزيعنا موثوق به أيضا في مجموعات الخلايا المصنفة. يكشف تحليل خلايا HELA التي تم فرزها إلى مراحل دورة خلية G0 أو G1 أو SG2M باستخدام مسبار FUCCI geminin عن وضع العلامات على السيتيدين في كلا المجموعتين مع تخصيب أعلى في مرحلة SG2M ، بما يتفق مع زيادة تخليق النيوكليوتيدات من جديد خلال المرحلة S.
في هذه التجربة ، أظهر نظير الكتلة من توزيعنا نفس النمط في كل من الكسور المصنفة لدورة الخلية ، مما يشير إلى استخدام نفس مسار التوليف ، ولكنه أكثر نشاطا في مرحلة SG2M ، مما يدل على أن الاختلافات الأيضية يمكن اكتشافها بسهولة بهذه الطريقة ، حتى بين المجموعات السكانية الفرعية ذات الصلة الوثيقة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخراج المستقلبات من الكسور المصنفة ، وفهم المحاذير. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر التعامل مع الخلايا بسرعة أثناء الفرز واستخراج المستقلب ، حيث يمكن أن تؤثر طريقة وطول الوقت الذي يتم فيه التعامل مع الخلايا على عملية التمثيل الغذائي لديها.
بمجرد إتقانها ، يمكن تنفيذ هذه التقنية في خمس ساعات. يمكن تطبيق هذا الإجراء على أنواع الخلايا الأخرى. على سبيل المثال ، مجموعات فرعية من الخلايا المناعية في الدم ، أو أنواع مختلفة من الخلايا داخل الورم ، باستخدام مجموعة متنوعة من المجسات أو الأجسام المضادة أو طرق التلوين للفرز.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المقالة طريقة لدراسة التمثيل الغذائي الخلوي في مجتمعات معقدة من أنواع متعددة من الخلايا. تجمع هذه التقنية بين تتبع النظائر المستقرة وترتيب الخلايا وتحليل الطيف الكتلي لتحليل الاختلافات الأيضية والتعاون بين المجموعات الفرعية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- التمثيل الغذائي الخلوي
- تتبع النظائر
- تحليل الطيف الكتلي
الخلفية
- فهم التمثيل الغذائي في مجتمعات خلوية معقدة أمر بالغ الأهمية للعديد من الدراسات البيولوجية.
- يتيح تتبع النظائر تحليلًا مفصلًا للمسارات الأيضية.
- يساعد ترتيب الخلايا في عزل أنواع معينة من الخلايا لقياسات أكثر دقة.
- يوفر تحليل الطيف الكتلي كشفًا حساسًا للمستقلبات.
هدف الدراسة
- لقياس التمثيل الغذائي للمجموعات المرتبة ضمن مجتمعات خلوية معقدة.
- للتحقيق في الاختلافات الأيضية بين المجموعات الفرعية.
- لاستكشاف التعاون الأيضي بين أنواع مختلفة من الخلايا.
الطرق المستخدمة
- زراعة الخلايا في وسط مسمى بالنظائر المستقرة.
- ترتيب أنواع معينة من الخلايا باستخدام تقنيات ترتيب الخلايا.
- استخدام تحليل الطيف الكتلي لتحليل المستقلبات.
- التحقق من موثوقية الطريقة من خلال العروض البصرية.
النتائج الرئيسية
- تعزيز فهم الاختلافات الأيضية في المجموعات الفرعية للخلايا.
- التعاون الموضح في التمثيل الغذائي بين أنواع مختلفة من الخلايا.
- التحقق من موثوقية الطريقة المدمجة.
- توفير إطار عمل مرئي للإجراء وتأثيره على التمثيل الغذائي للخلايا.
الاستنتاجات
- تقدم الطريقة نهجًا قويًا لدراسة التمثيل الغذائي الخلوي.
- يؤدي الجمع بين تتبع النظائر وترتيب الخلايا إلى بيانات أيضية موثوقة.
- يمكن تطبيق هذه التقنية في مجالات بحثية مختلفة تتضمن تفاعلات خلوية معقدة ودراسات أيضية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
This method addresses a key challenge in discovery biology: obtaining reliable metabolic measurements from heterogeneous cell populations without introducing sorting-induced artifacts. By leveraging stable isotope tracing and mass isotopomer distributions (MIDs), it enables de-risking of target validation through more confident assessment of subpopulation-specific pathway activity. The approach supports predictive confidence in early discovery by distinguishing true metabolic differences from procedural noise, informing go/no-go decisions in portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by revealing metabolic differences between subpopulations, such as elevated nucleotide synthesis in SG2M versus G1 phases.
- Operational Value: Provides a validation step using mock-sorted controls to confirm that MIDs remain unaltered by sorting stress, ensuring data integrity before downstream analysis.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by confirming pathway consistency (e.g., nucleotide synthesis) while quantifying activity differences across closely related states.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, reproducible MID readouts from sorted fractions that are amenable to high-resolution mass spectrometry and scalable across sample sets.
- Screening Readiness: Prepares validated biological systems for compound evaluation by establishing baseline metabolic profiles in defined subpopulations.
- Platform Reuse: The workflow—combining isotope labeling, sorting, and LC-HRMS—can be adapted to immune subsets or tumor microenvironments using alternative probes or staining methods.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase metabolic profiling to preclinical validation by enabling consistent measurement of pathway activity in sorted populations across experimental models.
- Risk-Adjusted Advancement: Facilitates prioritization of targets or mechanisms based on subpopulation-specific metabolic dependencies, reducing false leads in later stages.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, providing metabolic resolution that complements genomic and proteomic subpopulation analysis.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating metabolic signals specific to sorted subpopulations, such as cell cycle phases.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative metabolite enrichment data that enable reliable comparison of compound effects across defined fractions.
- Analytics: Generates mass isotopomer distributions and labeled carbon/nitrogen fractions that serve as stable, time-integrated readouts for pathway flux assessment.
- Translational Research: Enables continuity from sorted population analysis in vitro to preclinical models by preserving metabolic state fidelity through MID-based validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for metabolic phenotyping of any sortable subpopulation, reducing redundant method development across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in heterogeneous systems.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through internal controls (mock-sorted samples) that verify methodological robustness.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling earlier, more accurate go/no-go decisions based on subpopulation-specific metabolic dependencies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by highlighting metabolic vulnerabilities in distinct cell states, informing combination therapy or biomarker strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stable isotope labeling, flow cytometry sorting, and LC-HRMS data analysis for metabolite enrichment calculations.
- Depends on access to cell sorters, mass spectrometry platforms, and isotope-labeled media with dialyzed supplements.
- Necessitates standardized handling procedures to minimize metabolic drift during sorting and extraction, particularly for time-sensitive samples.
- Involves adaptation considerations when applying the method to primary cells or tissues with varying fragility or sorting efficiency.
- Includes practical limitations such as the need for rapid metabolite extraction post-sort to prevent ex vivo metabolic alterations, as noted in the protocol.
