تدفق Virometry لتحليل الأنتيجين أطياف Virions وخارج الخلية الحويصلات

تم التقاط الفيروسات أو الحويصلات خارج الخلية بخلايا نانوية مغناطيسية 15 نانومتر مقترنة بالأجسام المضادة التي تتعرف على المستضدات السطحية. تم تصنيف الفيروسات أو الحويصلات التي تم التقاطها بأجسام مضادة فلورية ضد مستضدات سطحية أخرى. تم فصل المجمعات الناتجة في مجال مغناطيسي عال وتحليلها باستخدام مقاييس التدفق الخلوي التقليدية التي يتم تشغيلها عند التألق.

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام الجسيمات المغناطيسية أو MNPs لتحديد مستضدات متعددة على سطح الفيروسات المفردة أو الحويصلات المفردة خارج الخلية باستخدام مقياس التدفق الخلوي التقليدي. يمكن أن تساعدنا هذه الطريقة في طبيعة العلاقة بين النمط الظاهري ووظيفة الحويصلات والفيروسات في الأمراض البشرية ، ولا سيما في العدوى الفيروسية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تسمح بتحليل الفيروسات المفردة أو الحويصلات المفردة خارج الخلية بدلا من التحليل السائب الذي تفقد فيه الخصائص الفردية لهذه الجسيمات.

يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للاختبار المناسب للجسيمات الفيروسية ، ولكن يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى بشرط توفر الأجسام المضادة المناسبة. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنه يجب التحقق من جميع الخطوات وفحصها قبل التحليل بما في ذلك الإعداد المناسب لمقياس التدفق الخلوي. ابدأ بدمج 60 ميكرولترا من MNPs لكل حالة ، وخمسة ميكرولترات من شظايا FAB المصنفة الخاصة بالنمط الإسمالي للجسم المضاد الملتقط ذي الأهمية في أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 ملليلتر.

احتضان المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة مع الخلط المستمر. ثم قم بتبليل مكثف 100 كيلو ب 300 ميكرولتر من PBS وقم بتدوير المكثف في جهاز الطرد المركزي الدقيق. في نهاية الطرد المركزي ، قم بتنقية المجمعات المسماة على عمود 100 كلفن متبوعا بطرد مركزي دقيق آخر يعلق الحبيبات في 200 ميكرولتر من PBS الطازج.

لالتقاط الجسيمات ذات الأهمية ، احتضان الجسم المضاد المسمى MNPs بالجسيم محل الاهتمام لفترة الحضانة ودرجة الحرارة المناسبة. بعد ذلك ، قم بحظر أي ارتباط FC غير محدد بالأنواع المناسبة من الأجسام المضادة IGG ، وقم بدوامة برفق واحتضان محلول الجسيمات لمدة ثلاث إلى خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف التركيز الموصى به من الشركة المصنعة لكل جسم مضاد للكشف إلى الجسيمات أو الأجسام المضادة للتحكم في النمط المتماثل إلى عينة التحكم في النمط المتماثل لمدة 20 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة.

لفصل الجسيمات الملتقطة MNP عن الجسم المضاد غير المرتبط ، ضع أولا عمود فصل مغناطيسي في مغناطيس فاصل وبلل العمود مسبقا ب 500 ميكرولتر من محلول الغسيل. اسمح للمخزن المؤقت للغسيل بالتدفق عبر العمود، ثم أضف مجمعات جزيئات MNP إلى العمود الذي يجمع التدفق في حاوية النفايات. عندما يمر كل المحلول المعقد عبر العمود ، اغسل العمود ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من محلول الغسيل.

ثم انقل العمود إلى أنبوب 12 × 75 ملم. بعد ثلاث دقائق ، أضف 200 ميكرولتر من PBS ، مما يسمح للخرز بالخروج بالجاذبية. عندما يمر كل PBS عبر العمود ، أضف 200 ميكرولتر من PBS الطازج إلى الأنبوب وقم بإصلاح الجسيمات ب 200 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهايد.

بعد ذلك ، قم بتحميل 0.22 ميكرون PBS مفلتر على مقياس التدفق الخلوي واضبط جهد PMT على مقياس الخلوي حتى يظهر PBS المصفى من صفر إلى عدد قليل جدا من الأحداث. ثم قم بتشغيل الجسيمات الملتقطة MNP باستخدام تدفق منخفض مع مرشح خطي 0.04 ميكرون لسائل الغمد الموضوع في سلسلة خلف مرشح غمد 0.2 ميكرون القياسي للقضاء على أي أحداث خاطئة. باستخدام قياس الفيروس بالتدفق ، أصبح من الممكن الآن تصور المستضدات الخلوية على الجسيمات الفيروسية الفردية.

على سبيل المثال ، في هذه التجربة ، لوحظ عدم تجانس كبير لفيرونات فيروس نقص المناعة البشرية -1 لوجود LFA-1 و HLA-DR مع التقاط الجسيمات الفيروسية التي كانت تعتمد على الخلايا التي تكرر الفيروس. يرتبط نضوج فيروس حمى الضنك بالتعبير عن بروتينات غشاء السلائف على الفيروسات والتي يمكن تمييزها باستخدام قياس فيرومتر التدفق كما هو موضح للتو. في هذه التجربة التمثيلية ، تم التقاط حويصلات خارج الخلية من البلازما الفقيرة للصفائح الدموية باستخدام العديد من الأجسام المضادة المقترنة ب MNP الفلورية للتحقيق في مجموعات فرعية مختلفة من الفيروسات خارج الخلية في المرضى الذين يعانون من متلازمة الشريان التاجي الحادة.

حدد تحليل قياس الفيروس للتدفق أنه في حين أن أعداد الحويصلات خارج الخلية الإجمالية زادت في الغالب في مرضى متلازمة الشريان التاجي الحادة مقارنة بضوابط المتبرعين الأصحاء ، فإن حجم الزيادة يختلف بين المجموعات السكانية الفرعية المختلفة للحويصلات خارج الخلية. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في غضون ساعتين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر إعداد مقياس التدفق الخلوي بشكل صحيح قبل بدء التحليل.

فتح تطوير هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال علم الفيروسات والبيولوجيا خارج الخلية للتحقيق في أدوار هذه الجسيمات في العمليات الطبيعية والمرضية في النظام المختبري وفي العينات البشرية والحيوانية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل أو قياس الطيف الكتلي للإجابة على أسئلة إضافية مثل البروتينات أو جزيئات الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي التي تحملها المركبات الكهربائية أو الفيروسات التي تم التقاطها على وجه التحديد. آمل أنه بعد مشاهدة هذا الفيديو يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل التركيب المستضد للفيروسات الفردية أو الحويصلات الفردية خارج الخلية.