توسع الأوعية السفن المعزولة وعزل مصفوفة خارج الخلية من الفئران ضيق الجلد

الهدف العام من هذه الإجراءات لعزل المصفوفة خارج الخلية وتوسع الأوعية خارج الجسم الحي هو دراسة العلاج بالببتيد المثبط IRF5 في القوارض. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة عن كيف يمكن للتغييرات في المصفوفة خارج الخلية أن تزيد أو تخفف من تطور المرض. الميزة الرئيسية لدراسات توسع الأوعية هي إعطائنا نظرة ثاقبة على العمليات في الجسم الحي دون الحاجة إلى أخذ جميع مكونات الإشارات في الاعتبار.

يمكن تطبيق عزل مصفوفة القلب خارج الخلية على أعضاء أخرى مثل الطرف الخلفي أو الرئة. خطرت لنا الفكرة لأول مرة عندما بدأنا في التركيز على ازدواجية الفيبريلين في فأر الجلد المشدود ، وأدركنا تأثير المصفوفة خارج الخلية المتغيرة وسلوك الخلية. بعد تخدير الفأر وإعداده للجراحة ، افتح الجلد باستخدام مقص.

القطع من الصدر إلى الجانب إلى عظم الفك مع الحرص على عدم إزعاج الأنسجة الأساسية باتجاه مقدمة الفك. ثم قم بتشريح الشريان اللبسيتي عن طريق إزالة الأنسجة الرخوة المحيطة به. أثناء القيام بذلك ، احرص على تجنب تلف الشريان.

استحم الأنسجة المكشوفة في عازلة للمماسح حتى تظل بصحة جيدة. بمجرد أن يتعرض الشريان اللفافي بالكامل ، أمسك اللفافة القريبة من أول تشعب بعيد إلى حيث سيتم قطع الشريان. ثم قم بقصه بعيدا عن الشريان الأم وامسك بالشريان اللفافي بالملقط.

اقطع الفرعين الخارجين من اللفافة ثم ارفع الوعاء برفق مع قطع الوصلات بالأنسجة المحيطة حتى يتم الوصول إلى التشعب. عند التشعب ، قم بقطع الشرايين الابنة لتحرير الوعاء وانقله إلى طبق من المماسح العازلة حيث سيبقى رطبا لحين الحاجة. لقياس توسع الأوعية ، استعد أولا لتسليط الأوعية.

قم بتحميل الماصات الزجاجية التي يبلغ قطرها الطرفي من 125 إلى 175 ميكرون مليئة بمخزن المؤقت للمماسحة. املأ أيضا خزانات المحلول بالمماسح. الآن قم بتسليط الأوعية المعزولة.

اربطها بماصات زجاجية باستخدام خياطة بصرية. تأكد من منع تكون فقاعات الهواء في الماصات. بعد ذلك ، قم بتركيب غرف الوعاء على مجهر مقلوب مع مرفق كاميرا الفيديو.

قم بتشغيل الفيديو من خلال نظام قياس الفرجار بالفيديو لقياس السفن على الشاشة. الآن اضغط على الأوعية باستخدام عملية من خطوتين. أولا ، ارفع المماسح المملوءة بالخزانات على ارتفاع فوق الوعاء لمدة 20 ملم من الزئبق من الضغط.

افتح الخط مع المماسح إلى السفينة. عندما يضغط الوعاء ، ابحث عن علامات التسرب حول الأربطة وأسفل طول الوعاء. إذا لم يتم العثور على تسريبات ، ارفع الخزانات لإنتاج 60 ملم من الزئبق من الضغط.

ثم افحص الأوعية بحثا عن التسريبات مرة أخرى. بمجرد الحفاظ على الضغط دون تسرب ، قم بموازنة الوعاء لمدة 30 دقيقة عند هذا الضغط. بعد التوازن ، قم بقياس توسع الأوعية استجابة لمركب الفائدة.

قم أولا بتضييق الوعاء بمقدار النصف إلى ثلاثة أرباع بإضافة U46619. دع المحلول يستحم الأوعية لمدة ست دقائق حتى يستقر. ثم أضف مركب الاختبار تدريجيا إلى محلول الحمام مثل الأسيتيل كولين.

كل دقيقتين ، قم بزيادة تركيز محلول الاختبار في الحمام بمقدار 10 بدءا من 000001 المولار والتقدم إلى 001 مولار. أثارت التغييرات في توسع الأوعية تساؤلات حول الإشارات. لكن تركيزنا ينصب على القلب.

لتقليل استخدام ، اخترنا عزل مصفوفة القلب خارج الخلية للتركيز على الإشارات التي تبدأ من الخارج. ابدأ بجمع القلب من فأر مخدر. انقله إلى دورق محمل ب 15 مل من كبريتات دوديسيل الصوديوم مفرط التوتر بنسبة واحد في المائة.

احتفظي بالمحلول مع التحريك برفق على طبق التحريك في درجة حرارة الغرفة لمدة 18 ساعة. في اليوم التالي ، قم بتغيير المحلول إلى 15 مل من 5 بالمائة تريتون X100 لمدة 30 دقيقة متبوعا ب 15 مل من PBS لمدة 15 دقيقة. ثم قم بتجميد ECM والنيتروجين السائل في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر.

بمجرد التجميد ، انقل الأنسجة إلى ملاط ومدقة مبردة مسبقا وطحنها إلى مسحوق. المسحوق في PBS مع مضاد حيوي مضاف بتركيز 1: 100 في محلول لزج. Sonicate تعليق لمدة 30 إلى 60 ثانية في حمام جليدي في إعداد صوتنة عالية.

يتم الآن عزل بروتين ECM ويجب أن يظل باردا. قبل استخدام البروتين ، قم بقياس تركيزه باستخدام فحص برادفورد. الببتيد IRF5D هو ببتيد مثبط يختلف اختلافا كبيرا عن IRF5 العادي.

IRF5D على 17 حمضا أمينيا فقط ويرتبط بموقع الفسفرة الخاص ب IRF5. هذا يمنع الفسفرة والتجانس ، وبالتالي يتداخل مع تكوين الحالة النشطة IRF5. تم علاج الفئران ذات الجلد المشدود متغاير الزيجوت باستخدام IRF5D تحت الجلد لمدة ثلاثة أسابيع.

تم تقليل عدد العدلات و CD64 على النحو الذي تحدده الكيمياء المناعية في متوسط عدد الخلايا الملطخة لكل مجال رؤية. أدت علاجات IRF5D إلى تحسين توسع الأوعية الناجم عن الأسيتيل كولين في الشرايين اللفافية في الفئران الجلدية المشدودة متغايرة الزيجوت التي عولجت ب IRF5D مقارنة بتلك التي عولجت بمحلول الفوسفات. في الخلايا العضلية المستنبتة المشتقة من أنسجة القلب للفئران المعدلة وراثيا ، كان هناك عدد أكبر من الخلايا الإيجابية IRF5 في مزارع الفئران غير المتجانسة الجلد المشدودة مقارنة بالفئران الضابطة.

أدت معالجة أي من المزرعتين باستخدام IRF5D إلى تقليل النوى الإيجابية ل IRF5. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إزالة الخلايا من القلب. بمجرد إتقانها ، يمكن نقل هذه التقنية إلى العديد من الأعضاء والمساعدة في الإجابة على مجموعة متنوعة من الأسئلة وتذكر أنه من المهم عدم الإفراط في هضم المصفوفة.

يجب أن يكون لديك أيضا فهم جيد لكيفية تشريح وتعليق الشريان اللفيسي. بمجرد إتقانها ، يجب أن تستغرق هذه التقنية حوالي 60 دقيقة ويمكن استخدامها على أي سرير وعائي تقريبا. من المهم أن تتذكر مدى هشاشة البطانة ، والمضي قدما بحذر أثناء التشريح.

ليس من غير المألوف أن يكون لديك عضلات ملساء صحية وبطانة تالفة.