باستخدام TMEM184A GFP الموسومة نبني لتأكيد الهيبارين مستقبلات الهوية

الهدف العام من استخدام بنية تحمل علامة GFP هو تأكيد هوية بروتين غير معروف سابقا باستخدام GFP كمقبض. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في التحديد الوظيفي للجينات اليتيمة عندما لا يكون نشاط إنزيم معين متاحا للتأكيد. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن علامة GPF تسمح باستخدام نفس البنية لعدة أنواع من التجارب.

بشكل عام ، قد يواجه الأفراد الجدد في هذه الطريقة مشكلة ، لأن التعدي لا ينتج عنه دائما تعبير قوي ، ولا تنتعش الخلايا دائما. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة ، عندما بدأنا في التعرف على صعوبات تحديد البروتين باستخدام الأجسام المضادة فقط التي تم إنشاؤها ضده. ابدأ بإعادة تعليق الخلايا ذات الأهمية في مليلتر واحد من مخزن التثقيب الكهربائي الملحي المخزن في HEPES وضع الخلايا على الفور على الجليد.

أضف حجما كافيا من البلازما الموسومة ب TMEM184A GFP إلى الخلايا لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 20 ميكروغراما لكل مليلتر من الحمض النووي ، وانقل ما يقرب من 0.4 مل من الخلايا إلى كوفيت كهربائي مبرد مسبقا. تثقيب الخلايا بالكهرباء. ثم انظر إلى الخلايا المنقولة على أطباق زراعة الأنسجة ، وضع الأطباق في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 24 إلى 72 ساعة.

خطوة التعدي هي الخطوة الأكثر أهمية في الإجراء ، لأن معظم الأعمال التجريبية المتبقية لا يمكن إكمالها بشكل فعال إذا كانت الخلايا غير قابلة للحياة ، ولا تعبر عن مستويات كبيرة من البنية التي تحمل علامة GFP. في النقطة الزمنية التجريبية المناسبة ، أضف 100 ميكروغرام لكل مليلتر من الهيبارين الرودامين إلى وسط زراعة الخلايا المعبر عن البلازميد GFP ، واحتضان الخلايا المحمية من الضوء ، حتى يتم الوصول إلى المستوى المطلوب من التلوين كما لوحظ في الفحص المجهري الفلوري. بعد ذلك ، اشطف الخلايا باستخدام PBS وبضع ثوان من الاهتزاز اللطيف ، المحمي من الضوء ، متبوعا بالتثبيت بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف.

لتقييم التوطين المشترك للرودامين هيبارين الموسوم ب GFP ، استخدم مجهرا متحد البؤر مع إثارة GFP و Rhodamine المناسبة والليزر المتضائل لتصوير ما لا يقل عن 50 خلية من كل تجربة وضع العلامات المنفصلة. افحص الصور في برنامج تحليل الصور المناسب لتحديد اكتشاف الرودامين النسبي وامتصاصه في كل خلية ، باستخدام أداة يدوية لوضع دائرة حول الخلايا داخل كل صورة فلورية. استخدم أداة القياس لتحديد الشدة داخل كل مساحة محاطة بدائرة ، ثم قم بتصدير بيانات شدة التألق إلى جدول بيانات لحساب المساحة مضروبة في الكثافة ، وطرح الخلفية لنفس المساحة لكل خلية.

يمكن بعد ذلك حساب متوسط التألق لكل خلية لجميع الخلايا ، للحصول على بيانات ذات دلالة إحصائية. لتسهيل نقل طاقة الرنين الفلوري من TMEM184A GFP إلى Rhodamine Heparin ، قام أولا بتركيب GFP الثابت TMEM184A نقل الخلايا المسماة بالهيبارين الرودامين على شرائح المجهر الزجاجي. قم بإثارة الخلايا عند 405 نانومتر لتصوير انبعاث الرودامين ، متبوعا بإثارة 488 نانومتر لتصوير انبعاث GFP.

ثم قم بإثارة الخلايا عند 561 نانومتر للحصول على تصوير ثان لانبعاث الرودامين. لتصوير الخلايا الحية لامتصاص الهيبارين الرودامين ، قم بزرع ثقافة أطباق ملتاقة سعة 100 مل لخلايا GFP المنقولة TMEM184A في أطباق تصوير الخلايا الحية 635 ملم للحصول على خلايا بالقرب من التقاء. بعد 48 ساعة ، استبدل المادة الطافية بوسط مزرعة بدون فينول أحمر ، وانقل طبقا من الخلايا إلى مجهر متحد البؤر مع ضبط مرحلة الاحترار على 37 درجة مئوية.

ركز المجهر ، وأضف 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من الهيبارين الرودامين إلى الخلايا بخلط لطيف. ثم ابدأ على الفور في تسجيل الصور الحية. إذا لم يحدث امتصاص للهيبارين في مجال الرؤية ، حرك الطبق قليلا لتحديد الخلايا التي تحتوي على حويصلة خضراء واحدة على الأقل ، تحتوي على ملصق الرودامين.

لتقييم ربط الهيبارين في المختبر ، اشطف صفيحة 96 بئر سوداء مطلية بالأتيفان ولوحة سوداء غير مطلية ب 96 بئر مع 200 ميكرولتر من 0.2٪ CHAPS PBS pro-well لمدة ثلاث غسلات مدتها خمس دقائق مع الاهتزاز. بعد الغسيل الأخير ، أضف 100 ميكرولتر من 60 بيكومول لكل بئر من مضادات GFP البيوتينيل في ثلاث نسخ إلى اللوحة المطلية بالأتيفان لكل مجموعة اكتشاف GFP. بعد ذلك ، أضف عازلة فقط إلى آبار التحكم وأغلق جميع الآبار بغطاء صفيحة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة مع الاهتزاز.

في نهاية الحضانة ، اغسل جميع الآبار ثلاث مرات في CHAPS PBS ، كما هو موضح للتو ، وأضف 100 ميكرولتر من خمسة نانومول لكل بئر من GFP TMEM184A ، أو GFP وحده ، إلى الآبار المناسبة في اللوحة المطلية بأتيفان. بعد حضانة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع الاهتزاز ، اغسل جميع الآبار باستخدام CHAPS PBS الطازج ، وأضف 100 ميكرولتر من كل تركيز تجريبي من الفلورسين-الهيبارين ، إلى آبار الاختبار المناسبة في ثلاث نسخ ، إلى اللوحة المطلية بأتيفان. أضف معايير التركيز إلى كل من الألواح المطلية بالأتيفان وغير المطلية ، واحتضن كلا اللوحين لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، مع الاهتزاز ، المحمي من الضوء.

الآن ، استخدم قارئ الألواح لتسجيل انبعاث الهيبارين الفلوري الأولي في آبار التحكم في كلا اللوحين ، وانبعاث التألق الكلي الأولي من الآبار مع TMEM184A GFP أو GFP الثابت في اللوحة المطلية بالأتيفان. ثم انقل الهيبارين الفلوري غير المرتبط من الآبار باستخدام TMEM184A GFP أو GFP الثابت إلى الآبار المقابلة في الصفيحة السوداء غير المطلية. بعد قراءة انبعاث التألق على الفور على الصفيحة السوداء غير المطلية ، أضف 100 ميكرولتر من CHAPS PBS الطازج مرة أخرى إلى الآبار التي تمت إزالة الفلورسين الهيبارين منها ، واقرأ انبعاثات التألق لهذه الآبار للحصول على انبعاث التألق من العينات التي تمت إزالتها وغير المرتبطة في اللوحة غير المطلية.

عندما يتم الحصول على جميع القراءات غير المنضمة ، استخدم إجمالي قيم انبعاث الهيبارين لتأكيد إضافة المستويات الصحيحة للهيبارين إلى كل بئر ، عن طريق طرح متوسط قراءات الخلفية من القيم. ثم قم بإنشاء مخطط للانبعاث مقابل إجمالي الفلورسين-الهيبارين المضاف ، لتحديد حجم الانبعاث مقابل كمية الهيبارين ، ورسم الهيبارين المصحح ، مقابل الهيبارين المضاف للنسخ الثلاثية من كل من آبار TMEM184A GFP و GFP. يؤثر طول الوقت بعد التعدي على توزيع TMEM184A GFP ، والذي يبدو أنه يتراكم على مدى 72 ساعة على الأقل ، مع ظهور المزيد من GFP في المنطقة شبه النووية بمرور الوقت.

يبدو أن نمط تلطيخ GFP في ثقافة الخلايا الوعائية التمثيلية هذه يشبه إلى حد كبير نمط الجسم المضاد الذي يتم رفعه ضد الببتيد الطرفي C ، وهي نتيجة منطقية ، بالنظر إلى أن GFP يقع في الطرف C للبروتين. يمكن أيضا استخدام ترابط الفلورسين والرودامين والهيبارين للتقييم في الوقت الفعلي للتوطين المشترك لمستقبلات الترابط بمرور الوقت. يزداد امتصاص الهيبارين في GFP TMEM184A بناء خلايا ضربة قاضية مستقرة منقولة ، مما ينتج عنه خلايا يمكنها استعادة القدرة على استيعاب الهيبارين الرودامين عند مستوى الخلايا البرية أو فوقها.

باستخدام نظام براعة GFP المشفر بالبلازميد المثبت ، يوضح بناء TMEM184A GFP المعزول للجسم المضاد المضاد ل GFP ارتباط محدد بالهيبارين ، في حين أن التحكم GFP لا يربط أي هيبارين. تلطيخ التألق المناعي البسيط بالأجسام المضادة مرة أخرى يمكن أن يوفر GFP أيضا معلومات حول موقع GFP ، بناء على وصول الأجسام المضادة في الخلايا غير المنفذة ، مما يوفر دليلا أوليا على أن GFP المعبر عنه في غشاء البلازما خارج الخلية. بمجرد إتقانها ، يمكن أن تؤدي هذه التقنية إلى تعبير ممتاز لبناء GFP ، بعد 24 إلى 48 ساعة من الثقافة.

أثناء محاولة بروتوكول التصوير الحي ، من المهم أن تتذكر أن بعض الخلايا قد لا تظهر امتصاصا موضعيا مشتركا ، لذلك غالبا ما يكون من الضروري فحص الخلايا الأخرى. يمكن أن تكون فحوصات الربط مع روابط GFP معقدة بسبب المجاميع الثنائية أو ذات الترتيب الأعلى لبروتين GFP ، خاصة إذا كانت في مذيلات المنظفات. بشكل عام ، يمكن أن يسهل التعبير عن البروتينات الموسومة ب GFP مجموعة متنوعة من التجارب لتأكيد هوية بروتين غير معروف سابقا.