صالحة يجند نانو الكتلة في الدهن طبقة ثنائية المعتمدة

الهدف العام لهذه التقنية هو تصنيع مجموعة من مجموعات البروتين النانوية في طبقة ثنائية دهنية مدعومة ، والتي تتوافق مع تقنيات الفحص المجهري السطحي الحساس لتطبيقات بيولوجيا الخلية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الفيزياء الحيوية للخلية ، على وجه الخصوص ، كيف يؤثر التجميع النانوي للروابط على تنشيط الخلايا التائية والتصاقها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها قابلة للتكرار بسهولة في المختبر الفيزيائي الحيوي القياسي وهي متوافقة مع تقنية الفحص المجهري الحساسة للسطح المتقدمة ، مثل TIRF و RICM.

على الرغم من أن هذه التقنية مصممة لتوفير نظرة ثاقبة في علم المناعة ، إلا أنه يمكن تطبيقها على أنواع الخلايا الأخرى ذات التطبيقات المحتملة في بيولوجيا الخلية والأورام وهندسة الأنسجة. لبدء هذا الإجراء ، قم بتنظيف شرائح الغطاء الزجاجي وغرف المراقبة كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد ذلك ، قم بإيداع 70 ميكرولترا من تعليق حبة السيليكا بنسبة 2٪ قطرة قطرة على شريحة غطاء مثبتة عند منحدر 15 درجة.

اقلب الزجاج 90 درجة كل 15 ثانية لمدة دقيقة واحدة بينما يجف نظام التعليق. من الأهمية بمكان إنشاء طبقة أحادية معبأة عن كثب من الخرز وتجنب تكوين طبقات متعددة ومجموعات زيتية. هذا هو السبب في أن تركيز وحجم محلول الخرزة بالإضافة إلى ماء الشريحة بحاجة إلى الأمثل.

بعد أن يتبخر السائل ، ضع الشريحة داخل جهاز اخرق المغناطرون بتردد الراديو على طاولة دوارة تقع على بعد 105 ملم من هدف سيليكون الألومنيوم. بعد ذلك ، استخدم مضخة توربينية جزيئية لتقليل الضغط في غرفة الترسيب إلى 2.6 في 10 إلى السالب الرابع الباسكال. أدخل جوا نقيا من الأرجون بتدفق 10 سنتيمترات مكعبة قياسية في الدقيقة وضغط 0.8 باسكال.

بعد ذلك ، قم بتشغيل مولد طاقة التردد اللاسلكي. بعد تثبيت البلازما، قم بالرش لمدة دقيقتين مع إبقاء الغالق مغلقا، لإزالة الشوائب المحتملة من السطح المستهدف. افتح الغالق ، واترك الاخرق يستمر لمدة 60 دقيقة لإيداع طبقة من الألومنيوم بسمك 200 نانومتر على الشريحة.

ثم قطع تدفق الأرجون. أغلق صمام البوابة لعزل المضخة الجزيئية التوربينية عن غرفة الترسيب. بعد ذلك ، قم بتنفيس الغرفة بالنيتروجين النظيف للوصول إلى الضغط المحيط.

استرجع الشريحة المطلية بالألمنيوم من الغرفة. اغمر الشريحة المستردة في ماء فائق النقاء في درجة حرارة الغرفة وفوق الصوت عند 50 واط و 50 هرتز لمدة 30 ثانية. بعد ذلك ، قم بإيداع 0.5 مل من APTES في الجزء السفلي من المجفف.

ضع الشريحة الزجاجية على شبكة خزفية. ضع الشبكة في المجفف. قم بتوصيل المجفف بمضخة غشائية.

ثم قم بتشغيل المضخة بأقصى طاقة لمدة 30 دقيقة لتوليد فراغ منخفض. أغلق صمام المجفف ، وقم بإيقاف تشغيل المضخة. يسخن إلى 50 درجة مئوية لمدة ساعة.

بعد ذلك ، افتح المجفف واجمع الشريحة. ضع الشريحة المجمعة على دعامة PTFE. إيداع 2 ملليلتر من 25 ميكروغرام لكل مليلتر البيوتين المذاب في PBS.

اترك الشريحة ترتاح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم اشطفه 10 مرات باستخدام PBS. احتضان الشريحة في محلول هيدروكسيد الصوديوم و PBS في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.

بعد ذلك ، اشطف الشريحة 10 مرات بالماء النقي للغاية. بعد تنظيف حوض Langmuir ، ضع صواني PTFE في حاوية PTFE الخاصة بالحوض الصغير. ثم املأه بالماء فائق النقاء.

اضبط الضغط المقاس على صفر مللي نيوتن لكل متر. باستخدام حقنة معدنية زجاجية محكمة الغلق ، قم بإيداع 30 ميكرولتر من 1 ملليغرام لكل ملليمتر DOPC ومحلول الكلوروفورم على سطح الماء. أغلق حاجز PTFE حتى يتم الوصول إلى الضغط المطلوب البالغ 27 مللي نيوتن لكل متر لضغط طبقة أحادية الدهون.

بعد ذلك ، باستخدام مشبك آلي ، قم بغمس الشريحة الزجاجية المعدة في حاوية PTFE. أمسك الشريحة في المشبك بشكل عمودي على واجهة الهواء والماء. ارفع الشريحة من خلال الواجهة بمعدل 15 ملم في الدقيقة مع الحفاظ على ضغط ثابت يبلغ 27 مللي نيوتن لكل متر.

بعد ذلك ، ضع الشريحة الزجاجية أفقيا على سطح الماء فوق صينية PTFE. بعد ذلك ، باستخدام ملاقط معدنية ، ادفع الشريحة لأسفل في صينية PTFE ، واغمرها في الماء فائق النقاء. استخدم الملقط لنقل صينية PTFE التي تحتوي على الشريحة إلى جهاز بلورة مملوء بالماء فائق النقاء.

انقل الشريحة المطلية تحت الماء إلى غرفة المراقبة. بعد ذلك ، أغلق الغرفة ، مع التأكد من احتجاز ما يقرب من 1 مليلتر من الماء بالداخل. خطوة أخرى حساسة هي تجميع غرفة العينة تحت الماء.

ويجب على المرء أن يتجنب تماما ملامسة هواء الطبقات الثنائية المترسبة ، لذلك لضمان استخدام كمية كبيرة من الماء والتأكد من أن عملية التجميع بأكملها يمكن أن تحدث تحت الماء. قم بإزالة الحجرة المجمعة من الماء ، وتأكد للتأكد من أن الغرفة مانعة لتسرب الماء وخالية من التسريبات. أضف 500 ميكرولتر من PBS ، ثم قم بإزالة 500 ميكرولتر من السائل من الغرفة.

كرر هذه العملية 10 مرات لاستبدال المليلتر الواحد من الماء فائق النقاء في الغرفة بالكامل ب PBS. بعد ذلك ، أدخل 100 ميكروغرام لكل مليلتر من زلال مصل الأبقار إلى غرفة المراقبة. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

بعد ذلك ، اشطف الطبقة الثنائية عن طريق إزالة وإضافة 500 ميكرولتر من الغرفة ، 10 مرات. بعد ذلك ، قم بالعمل باستخدام الروابط ، وقم بإيداع الخلايا ، ولاحظ النمط النانوي البروتيني وسيولة SLB كما هو موضح في بروتوكول النص. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام قناع الخرزة لإنشاء قناع معدني ثانوي عن طريق الترسيب المتحكم فيه للألمنيوم.

ثم تتم إزالة قناع الخرزة ، تاركا طبقة من الألومنيوم بها ثقوب. بعد ذلك ، يتم ترسيب سيلين عضوي أميني ، يسمى APTES ، في مرحلة البخار ، متبوعا بترسب BSA-Biotin في الطور المائي. بعد ذلك ، تتم إزالة الألومنيوم ، مما يكشف عن بقع البروتين النانومتري.

أخيرا ، يتم ملء المساحة بين النقاط مرة أخرى بطبقة ثنائية من الدهون مدعومة. ثم يتم التقاط صور Epiflourescence للنقاط النانوية والطبقة الدهنية الثنائية المدعومة. تظهر الصورة المركبة تكاملا مثاليا مع طبقة الدهون الثنائية المترسبة بشكل فريد حول نقاط البروتين ، ولكن ليس عليها.

في صورة epiflourescence لطبقة ثنائية من الدهون المدعومة حديثا ، تظهر نقاط البروتين على شكل بقع داكنة في بحر ساطع من الدهون. ومع ذلك ، بعد التبييض المستمر للصور لمدة 50 ثانية ، تظهر الصورة هالة داخل المنطقة محددة بواسطة الحجاب الحاجز الميداني ، مما يشير إلى أن الدهون متحركة. يكشف تحليل متوسط الكثافة على طول حافة الحجاب الحاجز الميداني ، واضمحلال هذه الشدة بمرور الوقت أثناء عملية التبييض ، أن ثابت الانتشار هو خمسة ميكرومتر مربع في الثانية.

يمكن القيام بهذه التقنية في غضون يومين إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. من المهم الحفاظ على ظروف نظيفة للغاية أثناء ترسيب الألمنيوم ، ومعايرة منحنى الترسيب بعناية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن زيادة تشغيل الشريحة المزخرفة.

على سبيل المثال ، عن طريق إضافة جزيء حيوي آخر في الطبقة الثنائية. نستخدم هذا لتقليد الخلايا الآكلة للنباتات المستضد ، من أجل دراسة تنشيط الخلايا التائية. لذلك بعد تطويرها ، يجب أن تثير هذه التقنية اهتمام جماهير متنوعة.

على سبيل المثال ، قد يرغب مهندسو الأنسجة في استخدامه كسقالة لزراعة الأنسجة الاصطناعية ، وقد يستخدم أطباء الأورام هذا كمنصة لطرح أسئلة أساسية حول إضافة الخلايا السرطانية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تصنيع منطقة من مجموعات البروتين النانوية في طبقة ثنائية الدهون المدعومة ، والتي تتوافق مع تقنية الفحص المجهري المتقدمة. بينما نستخدم هذا لدراسة الخلايا التائية ، نعتقد أن هذه الركيزة لديها القدرة على أن تصبح المنصة المفضلة لدراسة تفاعل أي نوع من الخلايا مع غشاء بروتيني متحكم فيه.