ديكستران يعزز كفاءة توصيل لينتيفيرال الخلايا ناغورني كاراباخ الابتدائي مورين والبشرية

الهدف العام من هذا البروتوكول هو صياغة تقنيات تسمح بنجاح ترنسدكشن الجينات في الخلايا القاتلة الطبيعية الأولية. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال العلاج المناعي، مثل تأثير التعديل الجيني على اللمفاويات المؤثرة، مثل الخلايا القاتلة الطبيعية، أو خلايا NK. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي التعبير الفعال عن جين مستهدف في خلايا NK الأولية للفئران أو البشر.

بعد تحضير ومعايرة النواقل اللنتيفيروسية (Lentiviral vectors) وفقاً للبروتوكول المكتوب، يتم تنقية خلايا NK الأولية الفأرية عن طريق تمرير معلقات الخلايا المفردة من الطحال عبر أعمدة صوف النايلون لاستنفاد المجموعات الملتصقة التي تتكون من الخلايا البائية والبلاعم. استخدم 1,000 units per milliliter من إنترلوكين-2 (Interleukin-2) في وسط RPMI1640 كامل لزراعة المجموعة غير الملتصقة التي تحتوي على خلايا NK. في اليوم الرابع من الزراعة، استبدل الوسط باستخدام 20 milliliters من وسط RPMI1640 كامل و 1,000 units per milliliter من IL-2 لإزالة خلايا T و NKT غير الملتصقة.

في اليوم السابع، استخدم الواسمات النوعية لخلايا MK للتحقق من نقاء خلايا NK الفأرية عن طريق قياس التدفق الخلوي، وذلك باستخدام تحضيرات تحتوي على مجتمع خلوي بنسبة تزيد عن 95% من الخلايا السالبة لـ CD3 والموجبة لـ NK1.1. لعزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي، أو PBMCs، قم بإضافة 35 milliliters من الخلايا المخففة إلى النصف بعناية فوق 15 milliliter من تدرج الكثافة في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. قم بطرد تدرج الكثافة مركزياً في جهاز طرد مركزي ذي دوار ذو سلال متأرجحة عند 400 ×g و 20 °C لمدة 30 دقيقة دون توقف.

بعد تنقية الخلايا القاتلة الطبيعية (NK cells) البشرية الأولية وفقاً للبروتوكول المكتوب، يتم تحديد نقاوة الخلايا عن طريق إضافة 2 µg/mL من أجسام مضادة لـ anti-CD3، و 2 µg/mL من أجسام مضادة لـ anti-CD56. تُحضن الخلايا عند درجة حرارة 4 °C لمدة 20 دقيقة. تُغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS.

بعد ذلك، قم بتحليل الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي. ستكون مجموعة خلايا NK موجبة لـ CD56 على سطح الخلية، وسالبة لـ CD3. قم بتعليق خلايا NK الأولية للفئران أو البشر في آبار لوحة ذات 24 بئراً بتركيز 0.5 × 10⁵ لكل مليلتر من الوسط مع طافي فيروس Lentivirus GFP، وبنسبة NLY تبلغ 5 و10 و20.

بعد ذلك، وفي وجود polybrene، أو protamine sulfate، أو dextran، يتم طرد الأطباق مركزياً عند 1,000 ×g لمدة 60 دقيقة. ثم، ودون سكب الطافي، تُزرع الخلايا في حضانة عند درجة حرارة 37 °C مشبعة بـ 5.2% من ثاني أكسيد الكربون طوال الليل.

بعد غسل الخلايا بـ 10 milliliters من PBS، استخدم two milliliters من وسط RPMI1640 مع IL-2 لإعادة تعليق الخلايا. وفي اليوم السابق لحصاد الخلايا، قم بطلاء أطباق بوليسترين ذات 96 بئراً وعالية الامتصاص للبروتين بـ 2.5 micrograms per milliliter من الأجسام المضادة أحادية النسيلة anti-MKG2D، واترك الأطباق في درجة حرارة الغرفة أو في الثلاجة طوال الليل.

في اليوم التالي، استخدم 100 µL من PBS لغسل كل بئر ثلاث مرات. يتم حصاد خلايا NK المنقولة عن طريق النقر بلطف على الأطباق أولاً، ثم إضافة 100 µL من الخلايا إلى كل بئر من أطباق 96-well. بعد مرور 16 إلى 18 ساعة على التنشيط، استخدم ماصة متعددة القنوات لجمع السوائل الطافية.

بعد ذلك، باستخدام السيتوكين المؤتلف من طقم ELISA، يتم إنشاء منحنى قياسي وتقدير كمية السيتوكينات، مثل Interferon Gamma في السائل الطافي. ولاختبار حيوية خلايا NK، وبعد مرور أربعة أيام على عملية التنحيط، تُغسل الخلايا بـ 10 milliliters من PBS البارد مرتين. ثم تُجمع الخلايا ويُستخدم XM5 7-aminoactinomycin D لصبغها.

استخدم قياس التدفق الخلوي لتحديد النسبة المئوية للخلايا النخرية بين خلايا NK المحولة، وقم بتحليل البيانات وفقاً للبروتوكول النصي. يوضح هذا الشكل أن خلايا NK البشرية التي تم تحضينها مع IL-2 المؤتلف ثم نقلت جينياً بواسطة Lentivirus GFP حققت كفاءة نقل أعلى وزيادة في العيار الفيروسي عند إضافة الدكستران إلى المزرعة، مقارنة بإضافة البولىبرين أو كبريتات البروتامين. وكما هو موضح هنا، ظهرت نتائج مماثلة في خلايا NK الفأرية، حيث عزز الدكستران من كفاءة ناقلات Lentiviral، مقارنة بالبولىبرين أو كبريتات البروتامين.

في هذه التجربة، تم فحص القدرة السامة للخلايا للخلايا القاتلة الطبيعية الأولية المنقولة جينياً عن طريق مقايسة تحرر الكرومين (CR-release assay) ضد خلايا K562 و YAC-1 كخلايا مستهدفة. ولا يؤدي نقل جينات الخلايا القاتلة الطبيعية بواسطة الديكستران إلى تغيير سلبي في إمكانات القتل للخلايا القاتلة الطبيعية المحولة مقارنة بالخلايا القاتلة الطبيعية غير المنقولة. وهنا، تم استنبات الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية الأولية المنقولة جينياً مع خلايا K562 لمدة 24 ساعة، وجُمعت السوائل الطافية لقياس إنترفيرون غاما.

تشير النتائج إلى أن الديكستران ليس له تأثير على قدرة خلايا NK المنقولة جينياً على إنتاج السيتوكينات. بالإضافة إلى ذلك، أظهر تحقق مستقل أن خلايا NK المعالجة بالديكستران والمنشطة باستخدام أجسام مضادة أحادية النسيلة anti-NKG2DA10 مثبتة على الطبق ظلت قادرة على إنتاج السيتوكين Interferon Gamma. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر القيام بطرد مركزي للخلايا المنقولة جينياً.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن استخدام طرق أخرى مثل عفن الخلايا (transfection) من أجل الإجابة على أسئلة إضافية، مثل كيفية تحسين إيصال الجينات. وقد مهدت هذه التقنية، بعد تطويرها، الطريق للباحثين في مجال علم المناعة لاستكشاف التلاعب الجيني في خلايا NK. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية نقل الجينات (transduce) إلى خلايا NK.