نموذج الالتهاب الرئوي القوي في مناعيا القوارض لتقييم مضاد للبكتيريا فعالية ضد S. الرئوية، H. النزلية، K. الرئوية، P. الزنجارية أو A. baumannii

الهدف العام من إجراء العدوى داخل الشعب الهوائية غير الجراحي هو إنشاء التهاب رئوي جرثومي قوي في القوارض المناعية. تضيف هذه الطريقة قيمة لاكتشاف وتطوير مضادات الجراثيم من خلال السماح بتقييم فعالية العلاجات المحتملة في نموذج مناعي للالتهاب الرئوي الحاد. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تؤسس عدوى رئوية قوية وقابلة للتكرار مع العديد من العزلات بما في ذلك تلك التي تتطلب عادة أن تكون عدلات أو معزولة لا تنتج عدوى قابلة للحياة بطرق أخرى.

بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذا الإجراء. التنبيب الصحيح هو إجراء أعمى يتطلب تعلم الإحساس الصحيح لتنبيب القصبة الهوائية بدلا من المريء. يختلف التنبيب الصحيح من عالم إلى آخر.

قد لا تكون الزاوية الدقيقة للقنية هي نفسها للجميع. الشعور بتلال القصبة الهوائية هو المفتاح. لتوضيح هذه التقنية ، ستكون سيندي مينينجر ، عالمة من مختبرنا.

للبدء ، قم بإعداد المعلقات البكتيرية المالحة من مزارع المرق الليلية ، كما هو موضح في بروتوكول النص ، أو من ألواح أجار ، كما هو موضح هنا. احصد النمو بين عشية وضحاها من ألواح الأجار باستخدام حلقة معقمة لكشط المستعمرات من السطح. انقل المادة المحصودة إلى خمسة ملليلتر من المحلول الملحي المعقم حتى يتم الحصول على تعليق غائم وغير شفاف ، وقم بدوامة الثقافة برفق حتى تصبح متجانسة.

بتخفيف حصة متسلسلة ثم قم بتقطيع حصة من كل تخفيف وفقا لبروتوكول النص. بعد تحضير الأجار وتجميع الأدوات اللازمة لعملية العدوى ، وفقا لبروتوكول النص ، قم بنقل تسعة ملليلتر من الأجار في أنبوب معقم ثم ضع الأنبوب في الحمام المائي حتى يوازن الأجار إلى حوالي 42 درجة مئوية. أضف ملليلترا واحدا من المعلق البكتيري الملحي المحضر مسبقا في أنبوب أجار.

ثم اقلب الأنبوب عدة مرات لخلطه وإعادته إلى الماء. ضع حصيرة نظيفة يمكن التخلص منها على سطح العمل بالقرب من الحمام المائي. لتحضير سطح العمل وجهاز التنبيب ، قم أولا بتعقيم القنية المعدنية وأنابيب البولي إيثيلين وفقا لبروتوكول النص ثم قم بنقلها في أنبوب التخزين الزجاجي الخاص بها إلى سطح العمل.

بعد ذلك ، قم بإزالة الغطاء من أنبوب التخزين وحرك طرف مقبض القنية إلى الطرف المفتوح للأنبوب. باستخدام ملقط معقم ، قم بإزالة طول واحد من أنابيب البولي إيثيلين من الدورق وأدخلها من داخل القنية المعدنية المعقمة ، مع التأكد من أنها تتحرك بحرية. ضع علامة إرشادية في مكان محدد مسبقا بقلم لا يمحى.

بعد ذلك ، ضع إبرة معقمة قياس 25 يمكن التخلص منها على الطرف الحر لأنبوب البولي إيثيلين عن طريق تحريك الإبرة عدة ملليمترات في الأنبوب. ثم استخدم محلول ملحي معقم لملء حقنة جديدة يمكن التخلص منها سعة مليلتر واحد. قم بتوصيل المحقنة بالإبرة المثبتة على أنبوب البولي إيثيلين وقم بغسل الحجم الكامل للمحلول الملحي عبر الأنبوب.

تخلص من المحقنة المستخدمة في حاوية الأدوات الحادة. بعد ذلك ، املأ حقنة جديدة معقمة يمكن التخلص منها بجرعة واحدة من المليلتر باللقاح القائم على أجار من الحمام المائي. أعد توصيل الإبرة والأنابيب قياس 25 وقم بتدفق أجار عبر الأنبوب عن طريق الضغط على المكبس حتى يمتلئ الأنبوب بالكامل بالأجار.

بعد تخدير الجرذ وفقا لبروتوكول النص ، ضع في وضع ضعيف على السجادة التي تستخدم لمرة واحدة بحيث يكون الرأس متجها لليمين والذيل متجها لليسار. بعد ذلك ، أدخل الطرف الحر من القنية المعدنية في فم. اقلب القنية بحيث تكون النهاية الحرة مائلة لأعلى وتقدمها برفق إلى القصبة الهوائية ، متجاوزة بعناية الهياكل الحنجرية بحركة التواء طفيفة.

تأكد من الإدخال في القصبة الهوائية ، على عكس المريء ، عن طريق تحريك القنية برفق للأمام والخلف عدة مرات أثناء استخدام السبابة اليسرى لجس حلقات القصبة الهوائية. لضمان التنبيب في القصبة الهوائية ، وليس المريء ، حرك القنية ذهابا وإيابا قليلا واشعر بالتلال. إذا انزلقت القنية بسلاسة أسفل الحلق ولا يمكن الشعور بالنتوءات ، فقم بإزالة الجهاز وحاول مرة أخرى.

عندما تصل القنية إلى التشعب حيث تنقسم القصبة الهوائية إلى الشعب الهوائية اليمنى واليسرى ، قم بحركة التواء طفيفة باتجاه الجانب الأيسر للحيوان لضمان إدخال القنية في القصبة الهوائية اليسرى. من الأخطاء الشائعة عدم وضع اللقاح بعمق كاف في الرئة مما قد يسد الشعب الهوائية ويمنع التنفس. عندما يتم تشغيل القنية إلى الزاوية المناسبة ، يجب أن تنزلق بسهولة إلى القصبات الهوائية اليسرى وتتقدم بسلاسة إلى العمق المناسب.

تقدم القنية المعدنية حتى تصل النهاية إلى منتصف الطريق إلى ثلاثة أرباع أسفل الرئة اليسرى ، باستخدام علامة التوجيه الموضوعة مسبقا للتأكد من الوصول إلى العمق المناسب. مع وضع القنية المعدنية في مكانها ، قم بتقديم أنبوب البولي إيثيلين عدة ملليمترات باستخدام علامة التوجيه الموضوعة مسبقا على الأنبوب للتأكد من تقدمه بما يكفي فقط للخروج من نهاية القنية المعدنية وعدم ثقب الرئة. مع وضع كلتا القنيات في مكانها ، استخدم المحقنة المرفقة لغرس 100 ميكرولتر من تعليق أجار في عمق الفص الكبير للرئة اليسرى.

اسحب عدة ملليمترات من الأنبوب وقم بإزالة جهاز التنبيب السليم برفق. ضعه مرة أخرى في أنبوب التخزين الزجاجي وانقل إلى قفص جديد للتعافي. قم بإعداد سطح العمل والقنية كما هو موضح للتو للفئران ، باستخدام المعدات ذات الحجم المناسب للفئران.

استخدم حقنة معقمة 1 مليلتر وإبرة معقمة قياس 25 لملء حقنة الحقن الدقيقة الزجاجية بمحلول ملحي معقم. ثم اغسل المحلول الملحي من خلال الجهاز المعاد تجميعه. بعد ذلك ، استخدم حقنة معقمة جديدة يمكن التخلص منها بسعة واحدة مليلتر وإبرة معقمة عيار 25 لملء حقنة الحقن الدقيقة بلقاح أجار.

بعد ذلك ، أعد تجميع الجهاز وقم بغسل الأجار عبر الأنبوب حتى يمتلئ الأنبوب بالكامل بالأجار. بعد تخدير الفأر وفقا لبروتوكول النص ، ضع في نفس الاتجاه كما هو موضح للفأر ، واستخدم ضغطا ثابتا ولكن لطيفا لتنبيب القصبة الهوائية بطريقة مماثلة كما هو الحال مع الفئران. تجنب استخدام القوة لأن هذه التقنية أكثر حساسية في الفئران.

تأكد من إدخال القنية في القصبة الهوائية عن طريق تحسس حلقات القصبة الهوائية. قم بتدوير القنية قليلا وتقدمها إلى القصبة الهوائية اليسرى ، مع إدخالها بعمق في الرئة باستخدام علامات التوجيه الموضوعة مسبقا. مع وضع القنية المعدنية في مكانها ، قم بتطوير أنابيب البولي إيثيلين عدة ملليمترات وغرس 20 ميكرولترا من تعليق أجار.

يظهر هنا مثال تمثيلي للمستعمرات التي تنمو على صفيحة أجار بعد التخفيف التسلسلي والطلاء الثلاثي لعينة متجانسة الرئة. كما هو موضح في هذا الرسم البياني مع S.pneumoniae ، عادة ما لوحظت زيادة في العبء البكتيري للعديد من القواعد اللوغاريتمية عشرة CFU فوق الضوابط الأساسية في الرئتين المصابة لمعظم العزلات البكتيرية ، حتى بعد 96 ساعة من الإصابة ، والتباين بين منخفض. في هذه التجربة ، تم تقييم مركبين مقابل عزلات الكينولون الحساسة أو المقاومة للكينولون من المكورات العقدية الرئوية لتوضيح أنه يمكن استخدام نموذج عدوى الرئة هذا أثناء تحسين سلسلة كيميائية من الرصاص لدعم علاقات نشاط الهيكل.

يمثل كل رمز CFU المحددة من رئتي فأر واحد. تظهر هنا نماذج E max التي تم إنشاؤها باستخدام بيانات فعالية تحديد الجرعات في الفئران ذات الكفاءة المناعية المصابة في الرئة بعزلات S.pneumoniae أو H.influenzae لتحديد الأهداف الدوائية والديناميكية الدوائية لمثبط جديد لتشوه بولي الببتيد. تمثل الدوائر متوسط العبء البكتيري من أربعة إلى خمسة فئران لكل مجموعة عولجت بجرعات متفاوتة من المركب.

تمثل الدوائر المفتوحة منطقة حرة تحت المنحنى وتمثل الدوائر المملوءة المنطقة الواقعة تحت منحنى وقت التركيز على الحد الأدنى للتركيز المثبط. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في حوالي 30 ثانية لكل ، مع تلقيح ما يصل إلى خمسة أو ستة لكل حقنة من لقاح أجار. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء هذه الطريقة غير الجراحية للعدوى داخل الشعب الهوائية وأن تكون قادرا على استخدامها لإنشاء التهابات الرئة مع العديد من العزلات البكتيرية المختلفة.

التحفيز النشط